青藏高原牦牛酸奶中降胆固醇乳酸菌的筛选及特性研究

张娟 李文苑 高利娥 马莹 丁梓桐 李福厚 郭旭生

兰州大学 生命科学学院益生菌与生物饲料研究中心，甘肃省，兰州市，730000

前言

现代生活中不健康的生活习惯和高糖高脂饮食摄入，会导致人体血清中胆固醇含量过高，从而引发多种疾病，例如心血管疾病，癌症和非酒精性脂肪肝等[1-3]，这些疾病威胁着人类的健康与生命。研究发现，一些乳酸菌具有较强的降胆固醇能力，服用乳酸菌或者乳酸菌发酵乳制品可以有效地降低实验动物和人体血清中的胆固醇含量[4-9]，因此近几年对乳酸菌降胆固醇活性的研究备受关注。目前已知乳酸菌降胆固醇机理，主要是通过（1）菌体吸收或菌膜吸附胆固醇；（2）分泌胆盐水解酶，将结合态胆汁酸水解为游离的胆酸，与胆固醇共沉淀；（3）胆盐水解酶将结合态胆汁酸水解为游离的胆酸和胆盐，游离态的胆酸不利于肠道吸收，继而被排出体外，宿主需要通过胆固醇合成新的胆酸维持正常代谢，以此来降低血清中的胆固醇含量[10-12]。

青藏高原地理环境特殊，这里的传统发酵牦牛奶含有丰富的乳酸菌资源[13]，由于牦牛奶中脂肪浓度相比普通牛奶更高，所以乳酸菌在传统发酵牦牛奶的高脂肪环境中长期适应，赋予它们天然的胆固醇降低能力[14，15]。本课题组在青藏高原不同地区采集传统发酵的牦牛酸奶样品，经过分离纯化后得到720株乳酸菌，首先对这些乳酸菌进行体外降脂溶性胆固醇能力试验，再通过稳定性较好的水溶性胆固醇进行复筛，意在筛选出高降胆固醇特性的优良菌株，为后续乳酸菌在降胆固醇动物实验和机制的研究中提供有力的依据。

1.实验

1.1 实验原料

分别在天祝、那曲、若尔盖、玉树、红原和玛曲不同牧区的牧民家中采集传统发酵牦牛酸奶样品202份。

1.2 方法

1.2.1 酸奶样品采集及处理

将牧民家采集的传统发酵牦牛酸奶样品分别装入灭菌后的冻存管中，快速送回实验室冻存。使用灭菌生理盐水稀释酸奶样品，取适当稀释度样品0.1 mL于MRS、M17和SL培养基中，涂布均匀，37℃厌氧培养48h，肉眼观察并记录培养皿中的菌落形态特征，挑取不同大小、颜色、光泽、边缘的菌落于MRS液体培养基中。

1.2.2 菌种分离纯化

将从样品中分离的乳酸菌活化3-4代，使用接种环蘸取菌液在MRS平板培养基上划线，培养48 h后挑取优势菌落，重复多次直至平板上的菌落形态一致，根据菌落的不同表观形态，确定为分离纯化后的菌株。再挑取单个菌落于MRS液体培养基中培养2-3代，加入甘油放入-80℃冰箱保存。

1.2.3 过氧化氢酶检测

菌株在MRS液体培养基中培养2-3代，用接种环蘸取菌液，在PYG斜面培养基划线接种，37℃恒温培养48 h后，向菌落滴加1-2滴3-15%（v/v）的过氧化氢，2-3分钟后观察是否有气泡。有气泡产生为阳性菌株，没有气泡产生则为阴性菌株。

1.2.4 乳酸菌降解脂溶性胆固醇降的筛选

准确称取100mg的胆固醇和220mg的卵磷脂于100mL的锥形瓶中（胆固醇与卵磷脂的摩尔比为0.9：1.0），加入5mL三氯甲烷溶剂溶解。通入N2吹干溶剂，加100mL 0.4 M的蔗糖溶液。通入N2，并在冰浴条件下超声波溶解15min，暂停5 min散热，循环三至四次，待充分溶解形成均匀胶体。4℃，38000g，离心20min取上清，得到卵磷脂-胆固醇胶束溶液，添加在液体MRS 培养基中（10%的卵磷脂-胆固醇胶束溶液于MRS液体培养基），即为MRS-Thio培养基。

调整待测菌的数量至1.0×109 cfu/mL，按1%（v/v）的接种量接种于含0.3%的牛胆粉的MRS-Thio培养基中，摇匀后立即取样1 mL，10000rpm/min，离心2min，取上清液0.5 mL，采用邻苯二甲醛法测定接种后培养液中的胆固醇含量。剩余的发酵液于37℃静置培养48 h，对照为不加菌液的含有0.3%的牛胆粉的MRS-Thio培养基。采用邻苯二甲醛法测定胆固醇的含量[11]，步骤有所改动，根据绘制的胆固醇标准曲线计算出胆固醇的含量。

A、B分别表示接种后培养液中的胆固醇含量和培养48 h后培养液中的胆固醇含量

1.2.5 乳酸菌降解水溶性胆固醇降的筛选

准备100μg/ml水溶性胆固醇溶液，在超净工作台用滤膜过滤除菌。取之前初筛出的72株乳酸菌解冻，活化3-4代后，调整菌的数量至1.0×109 cfu/mL，1%（v/v）的接种量于含0.3%牛胆粉的含水溶性胆固醇的MRS-Thio培养基中。水溶性胆固醇的添加量为100μL/mL。空白对照为不添加菌液的MRS-Thio培养基。取样1mL，10000 rpm/min，2min，取上清液0.5mL，采用邻苯二甲醛法测定接种后培养液中的胆固醇含量[16-18]。剩余的发酵液于37℃静置培养24h，邻苯二甲醛法具体测定胆固醇含量。胆固醇降解率与卵磷脂-胆固醇胶束法的胆固醇降解率计算方法一致，但B表示培养24h后培养液中的胆固醇含量。

1.2.6 16SrDNA分子生物学鉴定菌种信息

参照试剂盒的方法，提取乳酸菌总DNA，使用通用引物进行PCR扩增。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分析后，送至上海美吉生物DNA测序。将得到的菌株16SrDNA基因序列输入NCBI核酸数据库中进行比对，根据同源性来确定菌株的种属。对没有鉴定出的乳酸菌进行菌种特异性引物PCR[19]，特异性引物由生工合成。

1.2.7 数据分析

绘图使用Sigma Plot 17.0，数据统计采用SPSS 22.0统计软件，计量数据以均数±标准差表示，不同组间差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果与分析

2.1 乳酸菌分离纯化结果

从青藏高原6个地区（那曲、玛曲、红原、玉树、天祝和若尔盖）采集202份传统发酵牦牛酸奶。通过MRS、SL和M17选择性培养基的培养分离纯化，再经过氧化氢酶筛选阴性菌，如表1所示，得到720株乳酸菌。

表1 青藏高原不同地区牦牛酸奶分离的乳酸菌数量

2.2 乳酸菌对脂溶性胆固醇的清除率

如图1所示，720株乳酸菌均具有一定脂溶性胆固醇降解能力。降解率在80%以上的乳酸菌菌株共有12株，约占所有菌株的1.7%，其中一株BX39的胆固醇降解率高达90.05%。分离的菌株中有32株菌降解率为70%-80%，约占所有菌株的4.5%。脂溶性胆固醇降解率在60%-70%之间的菌株有49株，约占所有菌株的6.8%。在720株乳酸菌中，降解率在30%以下的菌株有393株，约占所有菌株的54.6%。脂溶性胆固醇降解率在68%以上的菌株，共有52株，具体降解率如表2所示。

图1 720株乳酸菌脂溶性胆固醇降解率分布情况

表2 720株乳酸菌降解脂溶性胆固醇能力，其中降解能力＞ 68%的52株

如表3所示，这6个不同地区的乳酸菌对脂溶性胆固醇降解率存在差异，若尔盖地区的乳酸菌降解率最高，为45.42%，并与其他地区都存在显著性差异；那曲地区的降解率次之，为37.73%，与其他五个地区的乳酸菌在降解脂溶性胆固醇方面也存在显著性差异；玛曲和天祝地区在降解率差异不显著，但与其他四个地区存在显著性差异；红原和玉树地区的乳酸菌降解率较低，且这两个地区没有显著性差异。结果说明地理位置和环境对乳酸菌的降解能力会有一定的影响。

表3 不同地区乳酸菌对脂溶性胆固醇的降解率的差异（±SD）

2.3 乳酸菌对水溶性胆固醇的清除率

挑选初筛时测定出的降解率在68%以上的52株乳酸菌，以及降解率在60%以下的20株乳酸菌作为比较，验证复筛结果的准确性，共计72株，测定菌株在含水溶性胆固醇培养液中的胆固醇降解率。72株乳酸菌的水溶性胆固醇降解率如图2及表4所示，在含水溶性胆固醇的培养液中，乳酸菌的降解率都很高，其中一株BT18的降解率达到了96.26%，在90%-95%之间的乳酸菌株达到了27株，约占72株乳酸菌的37.5%；降解率在80-90%之间的菌株达到了30株，约占总菌株的41.6%；降解率在68-80%之间的菌株共5株，约占总菌株的6.8%；50%以下的有9株乳酸菌，约占总菌株的12.5%。部分乳酸菌的降解率有一定幅度的变化，但是整体上初筛高降解率的乳酸菌，复筛时仍然保持一定高降解率，而且水溶性胆固醇的方法更加稳定。

图2 72株乳酸菌对水溶性胆固醇降解率的分布情况

表4 72株乳酸菌水溶性胆固醇降解率

2.4 乳酸菌16S rDNA的鉴定结果

如表6所示，通过16SrDNA基因测序及序列分析比对，以及菌种特异性PCR检测，72株乳酸菌株中共有2个属，分别是乳杆菌属（Lactobacillus）和片球菌属（Pediococcus）。乳杆菌属共68株，包括3个种，分别为罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。 片球菌属共4株，都为乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。72株乳酸菌株中罗伊氏乳杆菌约占88.88%，数量最多，这可能由于挑选菌株的时候，罗伊氏乳杆菌为培养基中的优势菌株。

表6 72株乳酸菌16S rDNA基因序列鉴定结果

3.讨论

本课题从青藏高原6个地区采集202份牦牛酸奶样品，经过MRS、SL和M17的选择性培养基分离纯化，过氧化氢筛选得到720株乳酸菌，筛选和初步了解乳酸菌的降解特性，将对今后的实验具有重大的意义。

胆固醇可以和强碱氢氧化钾发生皂化反应，加入乙醇是为了反应更充分。产生的酯类物质即固醇类化合物，可被正己烷萃取，与酸作用时，发生聚合反应，再和显色剂邻苯二甲醛结合，产生紫红色物质。乳酸菌降解脂溶性胆固醇试验中，720株乳酸菌都有一定的降胆固醇能力，不同地区的乳酸菌对胆固醇降解率存在差异，研究发现若尔盖地区的乳酸菌对胆固醇降解率均值最高，为45.42%，这说明来自青藏高原牦牛酸奶中的乳酸菌的胆固醇降解能力，有可能会受到地理环境的影响，具体原因尚未阐明。

复筛结果显示72株乳酸菌对水溶性胆固醇的降解率都很高，初筛时降解率偏高的菌株，复筛时降解率会增加或者降低；但是，挑选初筛时胆固醇降解率较低的菌株，其对水溶性胆固醇的降解率也较低。对比两种方法下测定的胆固醇降解率，水溶性胆固醇的降解率更具稳定性，重复之间的差异更小。

通过16S rDNA分子生物学鉴定，分析比对后发现，这72株乳酸菌中有64株罗伊氏乳杆菌、4株乳酸片球菌、3株瑞士乳杆菌和1株植物乳杆菌。罗伊氏乳杆菌的数量占比很大，且具有很高的胆固醇降解特性，具有较好的研究价值。

综上所述，青藏高原牦牛酸奶中乳酸菌的胆固醇降解率最高的为罗伊氏乳杆菌BT18，胆固醇降解率高达96.26%。本实验只是对青藏高原牦牛酸奶中具有降胆固醇特性的乳酸菌进行初步筛选，进一步了解乳酸菌的降解能力还需要进行大量体外益生特性研究，以及动物和临床的实验，以验证这些菌株的降胆固醇功效。此外，对乳酸菌的降胆固醇作用机理和代谢途径的探究，也是今后对青藏高原传统牦牛酸奶中乳酸菌的研究重点。