高效液相色谱-串联质谱法测定人血浆盐酸伪麻黄碱浓度

霍晓奎　王长远

摘要：目的  建立一种高效液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）测定人血浆盐酸伪麻黄碱浓度的方法。方法  血浆样品经液液萃取后，以甲醇∶水∶甲酸（60∶40∶1，V/V/V）为流动相，流速0.35 ml/min，采用Cap cell pack C18色谱柱分离，150 mm×2.1 mm，     5 μm（USA）;柱温20℃，选择离子喷雾离子化源串联质谱，通过正离子方式检测;选择反应监测（MRM）方式转化m/z=166.3/148.2（盐酸伪麻黄碱）和m/z= 152.2/134.15（内标苯丙醇胺）进行定量分析，用内标法测定含量。结果  伪麻黄碱浓度分别在5.0～400.0 ng/ml的范围内线性良好，R=0.9962，最低检测限为1.0 g/ml。结论  本方法操作简便、快速，结果准确，可用于该药物的含量测定，同时也可为临床药动学研究提供一定的参考。

关键词：伪麻黄碱;LC-MS/MS;血药浓度;药代动力学

中图分类号：R969.3                                文献标识码：A                                  DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.19.054

文章编号：1006-1959（2019）19-0163-03

Determination of Pseudoephedrine Hydrochloride in Human Plasma by High Performance

Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

HUO Xiao-kui，WANG Chang-yuan

（School of Pharmacy，Dalian Medical University，Dalian 116044，Liaoning，China）

Abstract：Objective  To establish a high performance liquid chromatography-mass spectrometry （LC-MS/MS） method for the determination of pseudoephedrine hydrochloride in human plasma.Methods  After the liquid sample was extracted by liquid-liquid extraction， the mobile phase was methanol：water：formic acid （60∶40∶1， V/V/V）， the flow rate was 0.35 ml/min， and separated by Cap cell pack C18 column， 150 mm×2.1mm，5 μm （USA）; column temperature 20°C， selective ion spray ionization source tandem mass spectrometry， positive ion detection; selective reaction monitoring （MRM） conversion m/z=166.3/148.2 （pseudoephedrine hydrochloride） and m/z=152.2/134.15 （internal standard phenylpropanolamine） for quantitative analysis， content determined by internal standard method.Results  The pseudoephedrine concentration was linear in the range of 5.0～400.0 ng/ml，R=0.9962， and the minimum detection limit was 1.0 g/ml.Conclusion  The method is simple， rapid and accurate， and can be used for the determination of the drug content. It can also provide a reference for clinical pharmacokinetic studies.

Key words：Pseudoephedrine;LC-MS/MS;Blood concentration;Pharmacokinetics

麻黃中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱成分为拟肾上腺类药物，是国家规定的需要严格控制的毒、麻类成分，盐酸伪麻黄碱有收缩上呼吸道血管的作用，可以用于鼻黏膜水肿的治疗，配伍使用抗组胺药，可用于过敏性鼻炎和感冒等的治疗。建立盐酸伪麻黄碱的含量测定方法具有重要的意义。目前盐酸伪麻黄碱的含量测定以高效液相色谱法为主，但该法存在检测灵敏度低，检测时间长等缺点。本研究建立了一种高效液相色谱、质谱联用法测定盐酸伪麻黄碱的含量，此方法简便、易行，结果可靠、准确，可为盐酸伪麻黄碱含量测定的质量控制标准提供参考，同时也可为临床药动学研究提供一定的参考，现介绍如下。

1仪器与试药

1.1仪器  Agilent 1200液相色谱仪，Applied Biosystems公司API3200型质谱仪，德国FLOM公司FCR 2002-UF型纯水机，德国Thermo公司ST-16R型高速离心机。

1.2试药  盐酸伪麻黄碱对照品，由中国生物制品检验鉴定所提供，含量99.8%;苯丙醇胺对照品（内标物，含量99.8%，100217-200303），由中国生物制品检验鉴定所提供，甲醇为色谱纯，购自Fisher试剂公司。其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱与质谱条件  色谱柱为Cap cell pack C18，150 mm×2.1 mm，5 μm（USA）;流动相为甲醇∶水∶甲酸（60∶40∶1，V/V/V）;流速为0.35 ml/min;柱温为20℃。离子源为ESI源;喷射电压（IS）5.5 kV;温度（TEM）650;鞘气（N2）流量（GAS 1）40 psi;辅助气（N2）流量（GAS 2）35 psi;气帘气（CUR）10 psi;去簇电压（DP）26 eV（盐酸伪麻黄碱）和26 eV（内标）;碰撞电压CE17 eV（盐酸伪麻黄碱）和17 eV（内标）;正离子方式检测：扫描方式为多反应监测MRM，选择的离子反应m/z=166.3/148.2（盐酸伪麻黄碱）和m/z=152.2/134.15（内标苯丙醇胺）进行定量分析，一次进样，双通道检测。

2.2溶液的制备  精密称取对照品（盐酸伪麻黄碱）5.0 mg和内标（苯丙醇胺）对照品3.0 mg，分别置于250 ml量瓶中，加水∶甲醇（50∶50，V/V）溶解并稀释至刻度，摇匀后得到母液。实验前用甲醇水稀释成所需标准溶液。

2.3血浆样品处理  取血浆0.5 ml，置10 ml具塞试管中，依次加入水100 μl，内标溶液（400 ng/ml苯丙醇胺水溶液）100 μl，2 mol/L NaOH 溶液100 μl。涡流30 s。加提取溶剂甲基叔丁基醚3 ml，涡流15 s，往复震荡10 min，3000 r/min离心10 min。分取上层有机相2 ml于40℃水浴中空气流下吹干，残留物加200 μl流动相溶解，取20 μl进样。

2.4方法专属性  在上述方法条件下，待测组分无内源性杂质干扰，待测物与内标峰形良好，盐酸伪麻黄碱与苯丙醇胺的保留时间分别为1.29 min和1.25 min，色谱图见图1。

2.5标准曲线与定量下限  在空白血浆中加入盐酸伪麻黄碱标准溶液，配置成浓度为5.0、10.0、20.0、40.0、100.0、200.0、400.0 ng/ml的标准曲线用血浆样品，按“2.3”中方法制备标准曲线。以浓度为横坐标，以峰面积比值为纵坐标，用Analyst 1.4.1数据处理系统软件，用加权最小二乘法进行回归计算，求得标准曲线的回归方程：y=0.0273x+0.0398（r=0.9962）（n=3）。线性范围：根据标准曲线，盐酸伪麻黄碱在5.0～400.0 ng/ml的范围内线性良好，定量下限为1.0 g/ml。

2.6方法回收率及精密度  按“标准曲线的制备”操作，制备盐酸伪麻黄碱次低、中、次高三个浓度（分别为10、40、200 ng/ml）的样品，5个样本，分别在同一天内测定5次和每天一次测定5天，计算日内、日间精密度，结果见表1。

3讨论

盐酸伪麻黄碱作为复方成分广泛用于感冒药中，用于减轻感冒症状。由于添加剂量一般较小，在人体内浓度较低。伪麻黄碱的血药浓度测定方法有很多种，尤其以高效液相色谱法较常见，但该法测定难度极大，分析时间长，并且灵敏度不高。随着质谱技术的发展， LC-MS/MS技术在血药浓度的测定中被广泛应用。在流速的考察中，选择0.2 ml/min、0.35 ml/min、0.5 ml/min等多个流速对盐酸伪麻黄碱色谱行为的影响，结果发现0.35 ml/min峰型最好，故最终流速选择0.35 ml/min;在检测模式的选择上，本研究分别考察了正离子和负离子的检测方式，发现正离子检测方式的灵敏度明显高于负离子的检测方式，因此选择了正离子模式;在样品处理环节中，考察了蛋白沉淀法和固相萃取法，结果显示蛋白沉淀法存在基质效应，影响测定的灵敏度和准确度，固相萃取法因提取回收率过低和价格高的原因被放弃，最终选择液液萃取的方法。

本研究采用LC-MS/MS测定人血浆盐酸伪麻黄碱的浓度，并采用液液萃取的方法处理样品。成功的净化了基质，排除内源性物质的干扰，且分析快速、灵敏度高、专属性强。日内、日间精密度及回收率等相关实验数据均符合国家标准。该测定血浆中的盐酸伪麻黄碱的方法符合有关规范要求，可用于药物代谢动力学试验。

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