豌豆蛋白和多糖同步提取工艺优化及其抗氧化活性研究

秦高一鑫 裴 斐 袁 彪 赵立艳 胡秋辉, 陈贵堂

(中国药科大学工学院1，南京 211198) (南京财经大学食品科学与工程学院;江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室2，南京 210023) (南京农业大学食品科技学院3，南京 210095)

豌豆，又名麦豌豆、寒豆、麦豆、荷兰豆(软荚豌豆)。原产地位于欧洲南部及沿岸，豌豆是一种适应性很强的作物，地理分布很广，全世界约有93个国家生产干豌豆，我国是世界第二大豌豆生产国，产量占全世界的三分之一[1,2]。豌豆的营养全面而均衡，富含蛋白质、碳水化合物和膳食纤维，同时脂肪含量很低，是B族维生素、叶酸和钙、铁、钾等矿物质的一个极好来源[3]。现代药理表明豌豆有增强机体免疫、防癌治癌等功效，药用价值十分明显。高豌豆的饮食可以有效降低结肠癌、Ⅱ型糖尿病、低密度脂蛋白胆固醇和心脏病的发病率[4]。

豌豆蛋白是一种优质的植物蛋白，占豌豆干质量的22%～25%，富含必需氨基酸异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和赖氨酸[5-7]。研究表明，豌豆蛋白在运动营养补充效果上媲美乳清蛋白，也有助于改善血压及肾病[8]。多糖是由多种单糖通过糖苷键连接组成的高分子化合物，具有多种生物活性。豌豆多糖是豌豆中的主要营养成分之一，水溶性好，黏度低，溶解后稳定性好且不易受温度、酸度及盐类的影响，是一种理想的天然食品添加剂[9-11]。糖蛋白由糖和蛋白两部分通过共价键连接组成，是生物体内的一种重要的生物大分子，在生长发育、信息传递、免疫系统、神经系统等多种生命活动中起重要作用[12-14]。目前对于豌豆蛋白的深入研究已经有诸多文献报道，但对于豌豆多糖的提取工艺研究很少，本研究在对豌豆蛋白提取的同时也对其多糖成分进行了提取，工艺步骤简单便于操作，大大增加了豌豆资源的利用。并对同步提取获得的2种样品进行抗氧化活性的测定，为其进一步的开发和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

过100目筛豌豆粉；牛血清白蛋白；L(+)-抗坏血酸，葡萄糖，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，2,2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)。

1.2 主要仪器

HH-8数显恒温搅拌循环水箱；WFJ-15型超微粉碎机；RE-5205旋转蒸发仪；TU-1901双光束紫外可见分光光度计；LXJ-ⅡB型低速大容量多管离心机；FD-1C-50冷冻干燥机。

1.3 实验方法

1.3.1 原料预处理

干豌豆用粉碎机粉碎，过100目筛，石油醚脱脂，50 ℃减压干燥后密封保存在低温干燥避光的环境中备用。

1.3.2 豌豆蛋白、多糖同步提取工艺

精确称取一定量豌豆粉，按照料液比加入一定量的蒸馏水，用1 mol/L的氢氧化钠调节提取溶液的pH，在设定温度条件下水浴搅拌提取一定时间，期间每隔30 min调节一次pH以维持提取液pH稳定。待提取液冷却至室温后4 000 r/min离心10 min，收集离心上清液，用1 mol/L的盐酸调节上清液的pH至豌豆蛋白的等电点，待蛋白质产生絮状沉淀后放入冰箱静置，使蛋白质进一步沉淀。4 000 r/min离心10 min，收集沉淀用95%乙醇洗涤沉淀，用0.02 mol/L pH为7.4的PBS复溶后透析，冷冻干燥，即得豌豆蛋白成品；上清液用1 mol/L的氢氧化钠调节pH至中性，旋转蒸发至适量体积，用Sevage试剂除蛋白3次，4 000 r/min离心10 min，收集上清液，加入3倍体积的95%乙醇，放入冰箱静置，使沉淀析出。4 000 r/min离心10 min，收集沉淀，分别用无水乙醇和丙酮洗涤3次后用蒸馏水溶解，透析后冷冻干燥，即得豌豆多糖成品。

1.3.3 豌豆蛋白等电点测定

将豌豆提取液离心后取上清液分成若干份，用1 mol/L的盐酸调pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，静置1 h，4 000 r/min离心10 min，将上清液定容至一定体积，通过考马斯亮蓝染液比色法测紫外吸光度，代入标准曲线计算沉淀前后上清液中蛋白质的质量，利用公式计算豌豆蛋白的沉淀率，选取沉淀率较高的pH范围，再以0.1为梯度调节pH对蛋白进行沉淀，测定沉淀率，沉淀率最大值对应的pH即为豌豆蛋白的等电点。

蛋白沉淀率=(酸沉淀前上清液中蛋白质的质量-酸沉淀后上清液中蛋白质的质量)/酸沉淀前上清液中蛋白质的质量×100%

1.3.4 单因素实验

分别考察pH 7.0、8.0、9.0、10.0、11.0；提取时间30、60、90、120、150 min；提取温度20、30、40、50、60 ℃；液料比20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 mL/g对豌豆蛋白和多糖提取率的影响，每组实验重复3次，取平均值。

1.3.5 正交实验设计

根据单因素实验结果，以蛋白和多糖同步提取率为考察指标，对pH、提取时间、提取温度、液料比4个影响因素按L9(34)的正交表排列进行实验，正交因素水平表如表1所示。

表1 正交实验因素和水平表

1.3.6 豌豆蛋白和多糖提取率、得率及纯度的测定

以牛血清白蛋白为标准品，利用考马斯亮蓝染液比色法[15]测定蛋白提取率；以葡萄糖为标准品，利用苯酚-硫酸法[16]测定多糖提取率。得率均采用称重法计算，蛋白和多糖冻干样品的纯度也采用比色法计算。

蛋白提取率=提取液中蛋白的质量(g)/原料的质量(g)×100%

多糖提取率=提取液中多糖的质量(g)/原料的质量(g)×100%

蛋白得率=蛋白冻干样品的质量(g)/原料的质量(g) ×100%

多糖得率=多糖冻干样品的质量(g)/原料的质量(g) ×100%

蛋白纯度=蛋白冻干样品中蛋白的质量(g)/蛋白冻干样品的质量×100%

多糖纯度=多糖冻干样品中蛋白的质量(g)/多糖冻干样品的质量×100%

1.3.7 抗氧化活性测定

分别配制不同浓度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)的豌豆蛋白溶液、糖蛋白溶液和抗坏血酸溶液，其中抗坏血酸作为阳性对照。

1.3.7.1 DPPH自由基清除率测定

参考文献[17]的方法，在2 mL不同浓度的样品溶液中加入3 mL 0.1 mmol/L用无水乙醇溶解的DPPH溶液，振荡摇匀，30 ℃水浴中避光反应30 min，于517 nm处测定吸光度值，DPPH自由基清除能力计算公式为：

清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A1为样品或抗坏血酸溶液的测定值；A2为样品溶液加入3 mL无水乙醇后的测定值；A0为空白对照，即2 mL的样品溶液换为2 mL的H2O后的测定值。

1.3.7.2 羟自由基清除率测定

参考文献[18，19]的方法，向2 mL不同浓度的样品溶液中加入1 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液和1 mL 6 mmol/L的H2O2，混合摇匀后静置10 min，然后加入1 mL 6 mmol/L用无水乙醇溶解的水杨酸，振荡摇匀后静置30 min，于510 nm处测定吸光度值，羟自由基清除能力计算公式为：

清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A1为样品或抗坏血酸溶液的测定值；A2为样品溶液加入2 mL蒸馏水和1 mL无水乙醇后的测定值；A0为空白对照，即2 mL的样品溶液换为2 mL的H2O后的测定值。

1.3.7.3 ABTS自由基清除率测定

参考文献[20，21]的方法，称取0.384 1 g ABTS和0.066 2 g过硫酸钾，用蒸馏水溶解后定容至100 mL容量瓶中，然后在室温下于暗处静置12～16 h。将生成的ABTS自由基溶液用0.01 mol/L pH 7.4的PBS稀释40～50倍，使其最终在734 nm处的吸光度值为0.70左右。移取1 mL不同浓度的样品溶液，加入1 mL蒸馏水和2 mL稀释后的ABTS反应液，振荡摇匀后在室温下于暗处静置6 min，于734 nm处测定吸光度值，ABTS自由基清除能力计算公式如下：

清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A1为样品或抗坏血酸溶液的测定值；A2为样品溶液加入3 mL蒸馏水后的测定值；A0为空白对照，即1 mL的样品溶液换为1 mL的H2O后的测定值。

1.4 数据统计分析

每个样品重复测定3次，用Microsoft Office Excel 2016数据处理软件求出平均值和标准偏差，数据用均值±标准偏差(x±s)表示。利用SPSS 19.0进行正交实验设计与方差分析。

2 结果与分析

2.1 豌豆蛋白等电点测定

由图1可知，豌豆蛋白在pH 4.0～5.0的范围内沉淀率达到最高值，说明豌豆蛋白的等电点在pH 4.0～5.0的范围内，在此范围内，豌豆蛋白的沉淀率先随着pH的升高而上升，在达到pH 4.2后显著下降。故豌豆蛋白在pH 4.2时沉淀率达到最大值，此时其蛋白溶解度最小，也就是它的等电点。

图1 豌豆蛋白等电点

2.2 单因素实验

2.2.1 提取温度对豌豆蛋白和多糖提取率的影响

从图2可以看出，在20～50 ℃范围内，随着温度的上升，由于溶质的扩散动力加大，同时溶液的黏度降低，溶质容易从原料扩散到提取液中，因此蛋白质的提取率随着提取温度的升高而增加，但超过50 ℃后可能由于部分蛋白发生变性而使其溶解度降低，提取率出现下降趋势；多糖的提取率随着温度的上升一直增加，当温度到达40 ℃之后，随着温度的上升提取率增加的趋势趋于稳定，同时考虑到过高温度对蛋白质变性和多糖糖苷键断裂的影响，综合两者的提取率选择较优的提取温度为50 ℃。

图2 提取温度对豌豆蛋白和多糖提取率的影响

2.2.2 pH对豌豆蛋白和多糖提取率的影响

从图3结果可以看出，在pH为7.0～9.0的范围内，蛋白质和多糖的提取率都随着pH的增大而增大。在pH为9.0时，蛋白提取率达最大，此时蛋白溶解较充分，继续升高pH，提取率不再增加反而呈现下降趋势，可能是过强的碱性引起了豌豆蛋白变性。多糖的提取率在pH 9.0～11.0的范围内基本保持稳定不再增加，综合两者的提取率故而选择较优pH为9.0。

图3 pH值对豌豆蛋白和多糖提取率的影响

2.2.3 液料比对豌豆蛋白和多糖提取率的影响

图4结果表明，在液料比20∶1～40∶1 mL/g的范围内，提取率随着液料比的增加而增加，可能是因为液料比较小时，提取体系的黏度过大，不利于物料扩散，导致蛋白质溶出速率小，随着液料比的增加，豌豆粉末与提取液接触面积越大，蛋白和多糖不断溶出。当液料比为40∶1 mL/g时，提取率达到最大，料液比继续增加，提取率不再增加甚至呈现下降趋势，故选较优液料比为40∶1 mL/g。

图4 液料比对豌豆蛋白和多糖提取率的影响

2.2.4 提取时间对豌豆蛋白和多糖提取率的影响

图5结果表明，蛋白质的提取率在提取时间为60 min的范围内，随着提取时间的增加而增加，当提取时间超过60 min后，提取率基本不再增加反而出现下降趋势；多糖的提取率在提取时间到达60 min前快速增长，但在60 min后提取率的增长变化几乎很小。考虑到在60 ℃的条件下提取时间过长会破坏蛋白质和多糖在溶液中的稳定性，使蛋白发生部分变性而使溶解度降低，使多糖部分降解而使得提取率下降，综合两者故选择较优提取时间为60 min。

图5 提取时间对豌豆蛋白和多糖提取率的影响

2.3 正交实验结果与分析

豌豆蛋白和多糖同步提取的正交实验结果如表2所示，极差分析如表3、表4所示。

表2 正交实验设计与结果

表3 蛋白提取率极差分析表

表4 多糖提取率极差分析表

分析可知，影响豌豆蛋白提取率的最主要因素为pH，最次要因素为提取时间，主次因素依次为A>D>B>C，最优水平组合为A3B3C3D2；影响豌豆多糖提取率的最主要因素为液料比，最次要因素为提取温度，主次因素依次为D>C>A>B，最优水平组合为A3B3C1D3。综合考虑影响蛋白和多糖提取率的主次因素，可以确定A、B、C3个因素的最优水平组合为A3B3C1，因为因素D(液料比)对于蛋白和多糖的提取率都有显著性的影响，蛋白的最优水平组合中为D2，多糖的最优水平组合中为D3，因此对2个工艺方案A3B3C1D2和A3B3C1D3都进行了验证，取其中蛋白质和多糖提取率高的为最优工艺方案，得到最优工艺方案为A3B3C1D3，即pH为10.0，提取温度60 ℃，提取时间30 min，液料比50∶1(mL/g)。

在最优工艺条件下进行3次平行实验，测得豌豆蛋白提取率为(23.88±0.56)%，多糖提取率为(8.43±0.12)%。

2.4 豌豆蛋白、多糖的得率及纯度

2.4.1 豌豆蛋白

采用称重法计算得到豌豆蛋白的得率为(6.12±0.06)%，使用比色法测定豌豆蛋白冻干样品的纯度为(96.29±0.68)%，对其中的多糖含量也进行了测定，多糖含量为(2.58±0.02)%。

2.4.2 豌豆多糖

采用称重法计算得到豌豆多糖的得率为(1.75±0.08)%，使用比色法测定豌豆多糖冻干样品的纯度为(27.12±0.15)%。由于纯度较低，配制了浓度为1 mg/mL的冻干样品溶液在紫外下进行了190～700 nm波长范围下的扫描，所得结果如图6所示。在210 nm和280 nm波长左右都有较强的紫外吸收，说明多糖样品中含有蛋白，采用比色法对其中的蛋白含量进行测定，蛋白质量分数为(52.63±0.67)%，可能是因为提取温度过高使蛋白和多糖发生了美拉德反应[22-23]，因此提取所获得的冻干样品实际为糖蛋白样品，测定其纯度为(79.75±0.67)%。

图6 多糖冻干样品紫外扫描图

2.5 抗氧化活性结果与分析

2.5.1 DPPH自由基清除率测定

豌豆蛋白和糖蛋白对DPPH·的清除效果如图7所示，豌豆蛋白和糖蛋白对DPPH·的清除能力均随着样品浓度的增加呈增长趋势，在质量浓度为1 mg/mL时均达到最大值，蛋白的清除率为10.84%，糖蛋白的清除率为35.08%。在相同的样品浓度下，糖蛋白对于DPPH·的清除效果比蛋白的清除效果强。

图7 豌豆蛋白和糖蛋白对DPPH·的清除效果

2.5.2 羟自由基清除率测定

羟自由基(·OH)是活性氧的一种，会使机体产生氧化损伤。豌豆蛋白和糖蛋白对羟自由基的清除效果如图8所示。豌豆蛋白对羟自由基的清除能力随着浓度的增加呈快速增长趋势，在质量浓度达到0.6 mg/mL后，增长趋势趋于平缓，在质量浓度为1 mg/mL时清除率达到最大值，为40.52%；糖蛋白在质量浓度达到0.8 mg/mL前，其对羟自由基的清除能力随着质量浓度的增加呈快速增长趋势，在质量浓度达到0.8 mg/mL后，增长趋势基本趋于稳定，在质量浓度为1 mg/mL时清除率达到最大值，为34.53%。在样品质量浓度小于0.4 mg/mL时，糖蛋白对羟自由基的清除能力优于蛋白；但当样品质量浓度大于0.4 mg/mL时，蛋白对羟自由基的清除能力更强。

图8 豌豆蛋白和糖蛋白对·OH的清除效果

2.5.3 ABTS自由基清除率测定

豌豆蛋白和糖蛋白对ABTS自由基的清除效果如图9所示，蛋白样品对ABTS自由基的清除能力随着质量浓度的增加呈持续增长趋势，在质量浓度为1 mg/mL时清除率达到最大值90.42%；糖蛋白样品的清除能力在质量浓度达到0.6 mg/mL之前随着质量浓度的增加而增加，当质量浓度大于0.6 mg/mL时，其对ABTS自由基的清除率基本保持稳定，并在1 mg/mL时达到最大值98.74%。

图9 豌豆蛋白和糖蛋白对ABTS+·的清除效果

3 结论

通过优化得到的同步提取工艺为：pH为10，提取温度60 ℃，提取时间30 min，液料比50∶1(mL/g)，此工艺下蛋白提取率可达到(23.88±0.56)%，多糖提取率为(8.43±0.12)%。获得的蛋白纯度达到了(96.29±0.68)%，得率为(6.12±0.06)%；由于发生美拉德反应，同步提取得到的另一个产品为糖蛋白，纯度为(79.75±0.67)%，得率为(1.75±0.08)%。

抗氧化实验中，豌豆蛋白和糖蛋白均具有一定的抗氧化活性，且在大多数情况下，同浓度的糖蛋白溶液的抗氧化能力要强于蛋白溶液，糖蛋白可能具有广阔的发展前景。