一份安康野桑蚕线粒体COI序列的克隆和分析

李 静，楚 渠，王瑞娴，彭云武，梁嘉俊，凌 君，孟 刚

(1.安康学院 现代农业与生物科技学院 , 陕西 安康 725000; 2.安康学院 陕西省蚕桑重点实验室，陕西 安康 725000)

安康位于秦巴山区腹地，野生资源丰富，是陕西主要的蚕桑生产区域，具有丰富的蚕桑种质资源。野桑蚕与家蚕同属于鳞翅目昆虫，是家蚕的祖先种，是培育家蚕优良种的重要基因资源和科学研究的宝贵材料[1, 2]。笔者单位长期以来从事野桑蚕种质的发现、保存和育种工作，野桑蚕的遗传特性、亲缘关系分析有利于该种质资源开发与利用的开展。昆虫线粒体DNA(mtDNA)是昆虫遗传多样性和系统进化研究的重要分子标记，进化速率是核基因组的5～10倍，无重复序列且在遗传过程中不发生基因重组、倒位、易位等变异，具有严格的母性遗传特性[3, 4]。细胞色素氧化酶I亚基(cytochrome oxidase subunit I, COI)是线粒体DNA中重要的蛋白编码基因，具有进化速率适中、保守性强、碱基变异丰富等特点[5]，可作为种属系统进化研究的良好标记，被广泛引用于种质鉴定[6]、种群遗传结构分析和分子系统发育分析。

利用线粒体序列研究野桑蚕聚类关系，一方面可以在分子水平上了解桑蚕的进化关系，另一方面有助于发掘秦巴山区丰富的野桑蚕种质资源，在蚕品种鉴定、种质改良和遗传育种上具有指导意义。笔者研究对1份安康野桑蚕线粒体COI基因及其两端侧翼序列进行了测序比较了其与石泉县野桑蚕的碱基差异；在此前研究基础上获得包括5份安康野桑蚕在内的17份中国野桑蚕、2份日本野桑蚕及31份家蚕线粒体相应序列[2, 7, 8]，分析了单位点多态性和安康野桑蚕的聚类关系，从分子水平上探讨安康野桑蚕与不同地理来源野桑蚕及与家蚕的亲缘关系。

1 材料与方法

1.1 样本

野桑蚕样本采自陕西省安康市，命名为akc20R2。另外，根据本单位此前的研究和 GenBank(https://www. ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)数据库，获得来源于安康汉阴县、岚皋县、汉滨区及石泉县(AY301620.2和GU966591.1)等地5份野桑蚕线粒体序列。从GneBank中获得11份国内野桑蚕、2份日本野桑蚕和31份家蚕(Bombyx mori)，以及天蚕(Antheraea yamamai)、柞蚕(Antheraea pernyi)和黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)等相应的线粒体序列。

1.2 线粒体基因组提取和序列扩增

采用酚-氯仿法抽提虫体全基因组，该方法获得的为细胞核基因组和线粒体基因组的混合物。野桑蚕蛹体用双蒸水反复清洗3次后，晾干，置研钵中，液氮冷却后迅速研磨至粉末，加入DNA抽提缓冲液(EDTA 0.1 mol·L-1，Tris-HCl 0.1mol·L-1，SDS 5 g·L-1)3 mL，消融后转入5 mL洁净离心管中，加入蛋白酶k(30 unit·mg-1，Sigma)至终浓度为150 μg·mL-1，置50℃水浴箱中消化3～5 h(每30 min混匀1次)。消化后的悬液按酚-氯仿法抽提DNA，紫外分光光度计检测质量。取1μL样品经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，基因组条带应位于TransPlus2000 DNA Marker指示剂5 000 bp条带之上，且电泳条带清晰明亮。基因组样本置-20℃保存备用。

1.3 引物

根据已登录的野桑蚕线粒体序列(GU966629.1)，针对目的片段设计简并引物。上游引物为5’-TGGTGCAGGAACAGGATGAAC-3’，下游引物为5’-GAGACCADTACTTGCTTTCAG-3’，预计产物长度为1 962 bp。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR扩增体系为50 μL，含总DNA模板(20 ng·μL-1) 1.0 μL，ddH2O 35.0 μL，10×缓冲液5.0μL，MgCl2(25mmol·L-1) 5μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1) 2.0 μL，上下游引物(2 μmol·L-1)0.5 μL，高保真聚合酶(5 u·μL-1)1 μL；反应条件为：94℃预变性4 min，94℃变性 40 sec，52℃退火40 sec，72℃延伸1 min，共32个循环，最后72℃延伸10 min，结束反应。

1.4 产物回收和测序

PCR产物采用1.20%(w/v)的琼脂糖凝胶电泳鉴定，切取目的条带，利用OMIGA胶回收试剂盒(OMIGA Gel Extraction Kit，美国)回收和纯化核酸片段，操作步骤按照试剂盒说明书进行。回收获得的PCR产物经检测合格之后，各选3份送交上海生工生物工程股份有限公司进行测序。

1.5 序列分析

使用Bioedit软件包逐条校对测序峰图，去除两端载体序列及机读错误之后导出序列。利用Clustalx软件进行核酸序列的同源性比对和相似性分析；DnaSP6.0(Rozas et al., 2017)检测单倍型和多态性位点, 计算核苷酸多样性(Pi)和单倍型(haplotype)多样度(Hd)。MEGA7.0(Tamura et al.,2007)构建进化树，构建方法为邻接法(neighbour-joining method, NJ)，(neighbor-joining)，参数设置为Bootstrap=1000，Poisson model，gaps/missing处理方式为pairwise deletion。

2 结果

2.1 序列扩增和凝胶电泳

凝胶电泳检测基因组抽提效果，在DNA marker对应的5 000 bp以上位置有单一条带，表明基因组质量可满足后续研究。利用线粒体特异引物进行PCR扩增，结果在预计的目的位置(1 962 bp)出现明亮、单一的条带(图1)，表明成功抽提出野桑蚕线粒体序列，且设计合成的特异性引物可扩增出目的序列片段。回收扩增产物，转入克隆质粒并扩大培养，收集质粒送交测序，获得扩增片段的核酸序列。

图1 基因组抽提和线粒体目的序列扩增检测

2.2 序列比对和核酸多态性分析

去除序列两端载体序列及机读错误之后，获得长度为1 873 bp的序列，将其进行blast比对，结果表明该序列与数据库中野桑蚕线粒体序列的一致性(identity)最高，且其中包含一段线粒体COI编码序列。将克隆所得序列与GenBank中的石泉县野桑蚕序列(AY301620.2和GU966591.1)进行比对，结果表明，其与石泉野桑蚕序列在163、203、213等48个核苷酸位点上表现差异。

从GenBank和文献报道中获得16份中国、日本野桑蚕相应的线粒体序列。位点多态性分析表明，17份中国野桑蚕在67个位点上存在碱基差异，平均核苷酸差异为25.596，核苷酸多样度为0.01368；2份日本野桑蚕在10个位点上存在差异，平均核苷酸差异为10.000，核苷酸多样度为0.00534(表1，表2)。与国内四川、江苏等地的野桑蚕相比，山东青州、陕西安康的野桑蚕有更为丰富的多态性单位点，同时安康野桑蚕在群体内表现出较高的相似性(表2)。

2.3 遗传进化分析

针对野桑蚕及家、野桑蚕两者之间的进化关系进行了聚类分析，其中包括本次克隆所得序列在内的6份安康野桑蚕线粒体相应序列(图3)。结果表明，家蚕与野桑蚕总体上分别聚为两大类群。与家蚕相比，野桑蚕具有显著的遗传多样性，表现为野桑蚕进化树枝长度存在显著差异，而家蚕不同品种之间的进化树枝长度较短。野桑蚕按照中国、日本各自聚为2大枝。6份安康野桑蚕总体上形成两个聚类，一是汉阴县、岚皋县、汉滨区及akc20R2与山东青州在同一枝下聚类，其中本次样本与岚皋县、山东青州亲缘关系较近，汉滨区和汉阴县样本与家蚕亲缘关系最为接近，在进化树上分别聚类为两个小的亚群；二是来源于安康石泉县的两份野桑蚕与四川、江苏、湖北等地的野桑蚕表现出较近的亲缘关系，聚集为一大类群(图3)。

图2 克隆序列与石泉2份野桑蚕线粒体相应序列的联配比对

种类序列数目计算长度单倍型数多态位点数平均核苷酸差异单倍型多样度核苷酸多样度中国野桑蚕171873176725.5961.0000.01368日本野桑蚕2187321010.0001.0000.00534

表2野桑蚕COI序列中具有单体型特征的位点

图3 野桑蚕线粒体COI序列的聚类分析

Ws指野桑蚕(wild silkworm)。akHanyin指安康市汉阴县；akNangao指安康市岚皋县；akHanbin指安康市汉滨区。实心圆指本研究中克隆所得序列，实心三角指文献报道或GenBank中的野桑蚕序列。

3 讨论

关于家蚕的起源，长期以来有多起源假说和单起源假说的争论[7]。基于线粒体的研究，鲁成等推理出家蚕是从不同的地域和时期进化独立进化而来[3, 9～14]。笔者研究克隆了一份安康野桑蚕长度为1 873 bp的线粒体片段序列，序列比对表明其与石泉县2份野桑蚕序列存在48处位点差异；聚类分析表明该野桑蚕与与岚皋县、山东青州亲缘关系较近，且与家蚕聚为大的类群，显示其与家蚕亲缘关系较近；综合与18份不同地域来源的野桑蚕、31份家蚕线粒体相应序列的聚类分析，表明6份安康野桑蚕可分为两大类，其一是石泉县2份野桑蚕与湖南、四川、江苏、湖北等地野桑蚕聚为一大类群，与家蚕亲缘关系较远，其二是包括本次研究在内的4份安康野桑蚕及山东青州野桑蚕与家蚕聚为一大类群，与家蚕亲缘关系较近，显示出秦巴地区野桑蚕复杂多样的遗传特性。