产肠毒素大肠杆菌3×STa-ovalbumin融合蛋白的血清学评价

王录军,王韦华

(渭南职业技术学院， 陕西 渭南 714000 )

Ⅰ型耐热肠毒素(Heat-stable toxin type I，STa)是产肠毒素性大肠杆菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)引起人和动物腹泻产生的两类主要肠毒素之一[1]。STa毒素是由18(猪源)或19(人源)个氨基酸组成的短肽[2, 3]。它们在氨基酸序列和生物学活性上具有相似性。但是由于STa毒素的分子量小，只有与载体蛋白偶联才具有免疫原性。STa基因在从幼龄动物、儿童和旅行者腹泻者分离的ETEC菌株中普遍携带[4, 5]。

虽然酶联免疫技术(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是检测ETEC疫苗诱导机体产生抗STa抗体的简单、快速和准确的方法，但是该方法的应用仍然面临一些问题。STa-ovalbumin化学偶联物是目前应用于ELISA检测STa抗体唯一的包被抗原[6, 7]。化学偶联的过程中要求纯化的STa毒素，但是纯化仅具有18或19个氨基酸的STa短肽，目前的技术还不成熟。虽然目前有几个实验室具备纯化具有生物活性的STa纯毒素的能力，但是通常产量低至每升生长培养基仅能纯化0.5～1 mg的STa纯毒素。另外，纯化的STa毒素和卵清蛋白(ovalbumin)化学偶联的效率也不高。这使STa-ovalbumin偶联物的供应量非常有限。因此，急需研发一种新的包被抗原替代目前应用的STa-ovalbumin化学偶联物。

1 材料和方法

1.1 菌株、质粒及试剂

E. coli DH5α，E. coli BL21(DE3)和pET-28α质粒均由渭南职业技术学院实验室保存。IPTG购于美国Sigma公司，IRDye标记的羊抗兔IgG购于美国NE公司，抗STa的阳性血清系美国堪萨斯州立大学Ronald教授馈赠，STa抗体阳性或阴性猪、兔和小鼠血清均为本实验室保存。

1.2 融合蛋白的构建和表达

3个拷贝的人源的estA基因(编码人源STa)利用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension?PCR，SOE-PCR)分别嵌合至修饰的鸡ovalbumin基因的N端、C端和中部。其中estA基因与ovalbumin基因N端、C端之间用GPVD接头连接。构建的3×STa-ovalbumin嵌合基因采用原核表达，纯化后的融合蛋白进一步用SDS-PAGE电泳分析；以兔STa阳性血清为一抗(1∶3 000)，IRDye标记的羊抗兔IgG(1∶10 000)为二抗，进行western Blot分析。

1.3 融合蛋白结构预测

先将3×STa-ovalbumin融合蛋白的氨基酸序列用Phyre2在线服务器对蛋白三级结构进行预测，PDB文件采用PyMOL软件对融合蛋白的表面结构进行分析。

1.4 最佳抗原包被剂量的优化

用方阵滴定法确定最佳抗原包被剂量：横列将融合蛋白抗原从每孔6.25 ng、12.5 ng、25 ng、50 ng或每孔10 ng STa-ovalbumin化学偶联物包被，竖排将血清按1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600和1∶51 200倍比稀释。混匀于37℃孵育1 h，用PBST洗涤3次；然后加用羊抗鼠IgG-HRP的二抗37℃孵育1 h。PBST洗涤3次后，每孔加入100μL的TMB室温显色30 min。在650 nm处以空白对照孔调零后读取各孔的吸光值(OD值)。OD650值与包被为每孔10 ng STa-ovalbumin化学偶联物的读值最为接近的确定为最佳包被剂量。试验重复3次。

1.5 敏感性和特异性检测

以每孔25 ng的融合蛋白剂量作为包被抗原，以猪抗STa抗体阳性血清连续倍比稀释(1∶400至1∶51 200倍)作为检测血清，采用间接ELISA方法检测其对抗STa抗体的敏感性。85份猪、兔和小鼠的抗STa阳性或阴性血清用于融合蛋白对抗STa抗体的特异性检测。所有血清样品先用每孔10 ng STa-ovalbumin化学偶联物作为包被抗原进行ELISA检测，确诊为抗STa阳性或阴性血清。当OD650读值减去空白对照孔读值>0.3时，结果判定为阳性，读值<0.3时，结果判定为阴性。试验重复3次，每个样品设置2个平行孔。

1.6 数据分析

实验数据统计采用Student's t-test 软件，当p<0.05时，判定为差异显著。

2 结果

2.1 融合蛋白的构建和表达

DNA测序结果确认3×STa-ovalbumin嵌合基因中包含3个拷贝的STa基因和内含子缩短的ovalbumin基因。3个STa基因分别位于ovalbumin基因的N端、C端和中间部位。融合蛋白以包涵体的形式表达，目的蛋白纯化后纯度超过90%，分子量大小约为40 KDa，与预期的大小一致；且能与兔抗STa阳性血清特异性反应 (图1)。

图1 3×STa-ovalbumin融合蛋白的Western blot分析

2.2 融合蛋白结构预测

蛋白结构预测结果表明，在N、C端和中间部位分别插入1拷贝的STa后并未破坏Ovalbumin蛋白的结构，进一步的分析表明，3个拷贝的STa均位于融合蛋白的表面(图2)。

图2 3×STa-ovalbumin融合蛋白的三级结构预测。白色标记的为STa多肽。

2.3 融合蛋白的最佳包被剂量

依据试验中方阵ELISA测试结果表明，当包被剂量为每孔50 ng时，检测抗STa阳性血清的敏感度最高。而当包被剂量为每孔25 ng时，其对STa抗体阳性血清的检测灵敏度与每孔包被10ng STa-ovalbumin化学偶联物的敏感度相当。所以每孔25 ng是3×STa-ovalbumin融合蛋白作为包被抗原检测抗STa阳性血清的最佳包被剂量。

2.4 敏感性和特异性试验结果

当选用每孔25 ng的融合蛋白作为包被抗原检测STa抗体阳性血清时，其检测血清的最高稀释倍数为1∶51 200 (图3)。与使用STa-ovalbumin化学偶联物作为包被抗原的ELISA检测比较，融合蛋白作为包被抗原检测的特异性为100% (表1)。

图3 抗STa抗体的敏感性检测

样品名称样品总数STa-ovalbumin化学偶联物作为包被抗原检测3×STa-ovalbumin融合蛋白作为包被抗原检测阳性样品数阴性样品数阳性样品数阴性样品数STa阳性血清48480480STa阴性血清37037037

3 讨论

评估ETEC疫苗有效性的最快速和可靠的方法是用ELISA方法检测疫苗诱导机体产生的抗体水平[8]。但是，目前检测机体的STa抗体水平仍面临居多挑战。STa-ovalbumin化学偶联物是当前应用ELISA方法检测抗STa抗体反应唯一使用的包被抗原[6, 7]。但是，STa-ovalbumin化学偶联物的制备程序复杂，而且产量低和不稳定。因此，目前急需研发一种替代STa-ovalbumin化学偶联物的新的包被抗原。我们的研究数据表明，3×STa-ovalbumin融合蛋白可作为抗STa抗体ELISA检测的包被抗原。

我们的试验证明，E. coli原核表达3×STa-ovalbumin融合蛋白产量高达40mg每升培养基，而且纯度超过90%。与STa-ovalbumin化学偶联物的制备方法相比，融合蛋白的制备方法简单、成本低，而且产量高。但是该融合蛋白的蛋白特性需进一步研究。用ELISA方法检测STa抗体时，用融合蛋白作为包被抗原与用STa-ovalbumin化学偶联物作为包被抗原具有相同的敏感性和特异性。但是，检测的敏感性和特异性还需要更多的样品进行验证。

总之，与STa-ovalbumin化学偶联物的生产相比，新的融合蛋白的生产更简单、快速和成本低廉，而且作为包被抗原对STa抗体的检测具有相同的效果。因此，我们的试验结果证明，新构建的3×STa-ovalbumin融合蛋白可以替代STa-ovalbumin化学偶联物作为ELISA方法检测STa抗体的包被抗原。