卵巢癌组织中带状疱疹透明带样结构域蛋白1 mRNA表达与肿瘤增殖、侵袭及自噬相关基因表达的相关性

路 娜，王炳淑，古吉敏

(1.宜宾市第二人民医院病理科，四川 宜宾 644000；2.海南医学院第二附属医院病理科，海南 海口 570311)

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，每2 500名绝经后女性中约有1人患卵巢癌。早期卵巢癌患者5 a生存率接近90%，然而，绝大多数患者被确诊时已是晚期，5 a生存率仅为10%～30%[1]。因此，如何在发病早期准确诊断卵巢癌显得尤为重要。目前，研究者们一直致力于寻找早期诊断卵巢癌的肿瘤标志物，其中研究最广泛的是糖类抗原125(carbohydrate antigen 125,CA125)，CA125敏感性较低，在Ⅰ期卵巢癌患者中的检测率约为50%；此外，CA125特异性也较低，在心包、子宫内膜等多种组织中均有表达；因此，不能满足卵巢癌早期诊断的要求[2]。寻找高敏感性和特异性的卵巢癌肿瘤标志物是当下临床研究的热点。带状疱疹透明带样结构域蛋白1(CUB and zona pellucida-like domains-containing protein 1,CUZD1)又称UO-44，该蛋白基因位于染色体10q26.13，编码607个氨基酸。LEUNG等[1]的研究已证明CUZD1是一种新型胰腺癌、卵巢癌生物标志物。本研究旨在观察卵巢癌组织中CUZD1 mRNA的表达水平，并进一步探讨CUZD1 mRNA表达水平与肿瘤增殖、侵袭及自噬相关基因表达的相关性，以明确该肿瘤标志物在卵巢癌辅助诊断、病情评估中的作用。

1 材料与方法

1.1 标本来源选取2018年1～10月宜宾市第二人民医院病理科保存的122例卵巢癌、72例卵巢囊肿和20例正常卵巢组织标本，且所有患者术前未进行放射治疗和化学治疗。卵巢癌患者年龄35～52(41.79±6.13)岁，卵巢囊肿患者年龄35～53(42.09±8.14)岁；正常卵巢组织为卵巢囊肿旁的组织，患者年龄34～53(41.98±7.95)岁。3组患者的年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究已获得医院医学伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器TRIzol、一步法反转录荧光定量试剂盒购自中国生工生物工程(上海)股份有限公司，引物均由中国生工生物工程(上海)股份有限公司合成，ABI 7500实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)仪、NanoDrop One微量核酸蛋白浓度测定仪购自美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 组织中RNA提取取0.1 g待测组织，匀速放入匀浆器中，加入1 mL 预冷TRIzol总RNA提取试剂，在冰上进行研磨直至成悬液，转移到1.5 mL的EP管中，4 ℃ 12 000×g离心10 min，弃沉淀并往上清中加入0.2 mL氯仿，震荡混匀15 s，室温下放置2 min，4 ℃ 12 000×g离心15 min；吸取上层透明液体，转移到新的1.5 mL的EP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，放置-20 ℃静置20 min，4 ℃ 12 000×g离心10 min；弃上清液。加入1 mL 体积分数75%乙醇，轻弹管底，使沉淀漂浮，4 ℃ 12 000×g离心10 min；弃上清液，管底中加入焦碳酸二乙酯水溶解(20 μL)沉淀。

1.4 RNA浓度和纯度的测定使用微量核酸蛋白浓度测定仪测RNA浓度，当RNA样品的核酸在260 nm处的吸光度值与蛋白质在280 nm处的吸光度值的比值在1.7～2.0时为纯RNA。

1.5 RT-qPCR检测各组织标本中增殖、侵袭及自噬相关基因的表达利用一步法反转录荧光定量试剂盒检测CUZD1 mRNA、增殖相关基因[β-连环蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、C-myc]、侵袭相关基因[核转录因子κB (nuclear factor kappa B,NF-κB)、钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、肿瘤转移相关基因1(metastsis associated gene 1,MTA1)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和整合素α2(integrin α2,ITGA2)]、自噬相关基因[bcl-2同源结构域样蛋白1(bcl-2 homeodomain protein 1,Beclin1)、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)]的表达情况，以β-actin和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)为内参基因，所用引物序列见表1。20 μL反应体系：2× onestep RT-qPCR Master Mix 10 μL、正向引物200 nmol、反向引物200 nmol、RT enzyme Mix 0.65 μL、RNA Template 4 μL、剩余体积用ddH2O补足。反应程序：42 ℃反转录 30 min，95 ℃预变性 3 min，95 ℃变性10 s、50～60 ℃退火(以基因为准)10 s、72 ℃延伸/采集荧光信号 30 s (40个循环)。ABI7500 RT-qPCR仪自动生成熔解曲线。用无模板和无转录反应模板作阴性对照。2-△△Ct的方法进行相对定量分析。

表1 RT-qPCR所用引物序列

Tab.1 Primer used for RT-qPCR

引物名称序列(5′→3′))上游下游β-cateninTCCCAAGTCCTGTATGAGTGTGCCCTCATCTAATGTCTCAGCyclin D1CGGTGTCCTACTTCAAATGTGGGCAAACTTCAAAGTTCTAGCC-mycCTGAGATGAGTCGAATGCCTCTTCTCCTCTCCCATCTTGACGAPDHTGTTCCAATATGATTCCACCTTTCTTCCATTCTGTCTTCCβ-actinATGAAGGCTTTTGGTCTCACTCTGGGTAAGGACAAGNF-κBTATCAGACGCCATCTATGACAGAAATCTCCAAATCCTTCCCAGACVimentinGAGCAGCAGAATAAGATCCTGCTTTGTCGTTGGTTAGCTGGMMP-9CACCACAACATCACCTATTGGAGACACCAAACTGGATGACGAVEGFCAGATTATGCGGATCAAACCTAAACAAATGCTTTCTCCGCTITGA2AAATGTCCTGTTGACCTATCCCCGTTGTGTAATACTGATTCCE-cadherinCATTTCTTGGTCTACGCCTGGAGAGGAGTTGGGAAATGTGBeclin1CCATTTATTGAAACTCCTCGCCGGGTGATCCACATCTGTCTGLC3GCTACAAGGGTGAGAAGCAGTCTCCTGCTCGTAGATGTCCMTA1GACTACGTCTACTTTGAGAACTCCCCTTATAGCAGACTGACAGGG

2 结果

2.1 卵巢癌、卵巢囊肿及正常卵巢组织中CUZD1 mRNA表达比较卵巢癌、卵巢囊肿及正常卵巢组织中CUZD1相对表达量分别为947.354±24.263、367.944±16.256、2.116±0.032，卵巢癌组织中CUZD1 mRNA相对表达量显著高于卵巢囊肿和正常卵巢组织，差异有统计学意义(P<0.001)；卵巢囊肿组织中CUZD1 mRNA相对表达量显著高于正常卵巢组织，差异有统计学意义(P<0.001)。

2.2 卵巢癌、卵巢囊肿及正常卵巢组织中增殖相关基因相对表达量比较结果见表2。卵巢癌组织中β-catenin、Cyclin D1、C-myc基因相对表达量显著高于卵巢囊肿和正常卵巢组织，差异有统计学意义(P<0.05)；卵巢囊肿组织中β-catenin、Cyclin D1、C-myc基因相对表达量显著高于正常卵巢组织，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 卵巢癌、卵巢囊肿及正常卵巢组织中增殖相关基因相对表达量比较

组织类别nβ-cateninCyclin D1C-myc正常卵巢组织201.261±0.0512.497±0.0071.124±0.006卵巢囊肿组织7231.815±2.589a31.312±3.461a62.101±7.238a卵巢癌组织12270.906±6.259ab112.889±14.217ab118.301±21.381abF2 514.0001 741.000556.200P<0.001<0.001<0.001

注：与正常卵巢组织比较aP<0.05；与卵巢囊肿组织比较bP<0.05。

2.3 卵巢癌、卵巢囊肿及正常卵巢组织中侵袭相关基因相对表达量比较结果见表3。卵巢癌组织中NF-κB、Vimentin、MTA1、MMP-9、VEGF、ITGA2基因相对表达量显著高于卵巢囊肿和正常卵巢组织，差异有统计学意义(P<0.05)；卵巢癌组织中E-cadherin基因相对表达量显著低于卵巢囊肿和正常卵巢组织，差异有统计学意义(P<0.05)；卵巢囊肿组织中NF-κB、Vimentin、MTA1、MMP-9、VEGF基因相对表达量高于正常卵巢组织，差异有统计学意义(P<0.05)；卵巢囊肿组织与正常卵巢组织中ITGA2、E-cadherin基因相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 卵巢癌、卵巢囊肿及正常卵巢组织中侵袭相关基因相对表达量比较

组织类别nNF-κBVimentinMTA1VEGFITGA2MMP-9E-cadherin正常卵巢组织2010.234±1.0628.412±1.122.366±0.0753.340±0.1920.926±0.0761.264±0.0261.236±0.051卵巢囊肿组织7257.617±5.363a44.079±5.263a6.057±1.263a14.863±0.160a1.139±0.0923.982±0.145a1.124±0.039卵巢癌组织1225 384.312±203.564ab694.330±52.638ab272.705±35.269ab789.208±56.280ab92.452±9.264ab145.651±10.236ab0.062±0.002abF31 420.0007 110.0002 628.0008 714.0004 447.0008 833.00041 490.000P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

注：与正常卵巢组织比较aP<0.05；与卵巢囊肿组织比较bP<0.05。

2.4 卵巢癌、卵巢囊肿及正常卵巢组织中自噬相关基因相对表达量比较结果见表4。卵巢癌组织中Beclin1、LC3基因相对表达量显著低于卵巢囊肿和正常卵巢组织，差异有统计学意义(P<0.05)；卵巢囊肿组织中Beclin1、LC3基因相对表达量显著低于正常卵巢组织，差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 卵巢癌、卵巢囊肿及正常卵巢组织中自噬相关基因相对表达量比较

组织类别nBeclin1LC3正常卵巢组织202.892±0.0613.650±0.074卵巢囊肿组织720.026±0.003a0.314±0.023a卵巢癌组织1220.019±0.004ab0.007±0.001abF215 100.000171 300.000P<0.001<0.001

注：与正常卵巢组织比较aP<0.05；与卵巢囊肿组织比较bP<0.05。

2.5 卵巢癌组织中CUZD1 mRNA表达与增殖、侵袭及自噬相关基因表达的相关性Pearson相关性分析显示，卵巢癌组织中CUZD1 mRNA表达水平与增殖相关基因β-catenin、Cyclin D1和C-myc表达水平呈正相关(r=0.998、0.990、0.988，P<0.05)；与侵袭相关基因NF-κB、Vimentin、MTA1、VEGF、ITGA2、MMP-9表达水平呈正相关(r=0.926、0.946、0.928、0.928、0.924、0.930，P<0.05)，与侵袭相关基因E-cadherin表达水平呈负相关(r=-0.954，P<0.05)，与自噬相关基因Beclin 1、LC3表达水平呈负相关(r=-0.928、-0.931，P<0.05)。

3 讨论

CUZD1是催乳素(prolactin,PRL)/催乳素受体(prolactin receptor,PRLR)-Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)/信号转导和转录激活因子5(signal transducers and activators of transcription 5,STAT5)信号传导通路的调节因子。已有研究表明，过表达CUZD1促进肿瘤的发生，沉默CUZD1表达抑制STAT5信号通路可能为治疗肿瘤提供一种策略[3]。β-catenin是Wnt信号通路中的重要因子，与E-cadherin组成复合体，激活Wnt信号通路，参与肿瘤的发生及增殖。胡艳萍等[4]研究表明，β-catenin在食管鳞状细胞癌组织中过表达。Cyclin D1在细胞周期失调控中扮演关键角色，是参与肿瘤细胞早期形成和生长的癌基因[5-6]。C-myc是一种转录因子，参与多种肿瘤的发生与发展[7]。本研究结果显示，卵巢癌组织中CUZD1相对表达量显著高于卵巢囊肿和正常卵巢组织，卵巢囊肿组织中CUZD1相对表达量显著高于正常卵巢组织，且卵巢癌组织中CUZD1 mRNA表达水平与增殖相关基因β-catenin、Cyclin D1和C-myc mRNA表达水平呈正相关，表明CUZD1表达水平可以反映卵巢癌细胞的增殖活性。

卵巢癌侵袭转移的一般规律是：首先，肿瘤细胞从原发瘤处脱落，侵入其邻近细胞外基质；激活各种降解酶类，降解所黏附的组织，形成空隙，使卵巢癌细胞移动；然后在多种促血管因子的作用下着床的癌组织形成新生血管，最后癌细胞经过免疫逃逸而增殖形成转移灶[8-9]。NF-κB属于Rel蛋白家族，广泛存在于真核细胞内，其可通过促进肿瘤血管形成、诱导细胞外基质降解等途径促使癌细胞侵袭和转移[10]。Vimentin高表达和E-cadherin表达缺失被认为是肿瘤细胞上皮间质转化分子标志物的典型代表[11]。MTA1是与肿瘤转移有关的基因家族成员之一，在胰腺癌等多种肿瘤中高表达[12]。MMP-9能够降解细胞外基质Ⅳ型胶原，促进肿瘤的侵袭与转移[13-14]。VEGF是特异的内皮细胞有丝分裂素，可以促进血管生成，在肿瘤侵袭与转移过程中具有重要作用[15]。ITGA2是细胞与细胞外基质相互作用的最重要的受体，研究显示，ITGA2参与肝癌细胞的侵袭和转移过程[16]。本研究结果显示，卵巢癌组织中NF-κB、Vimentin、MTA1、MMP-9、VEGF、ITGA2基因相对表达量显著高于卵巢囊肿和正常卵巢组织，E-cadherin基因相对表达量显著低于卵巢囊肿和正常卵巢组织；且卵巢癌组织中CUZD1 mRNA表达水平与NF-κB、Vimentin、MTA1、VEGF、ITGA2、MMP-9基因表达水平呈正相关，与E-cadherin基因表达水平呈负相关，表明CUZD1表达水平可以反映卵巢癌细胞的侵袭活性。

自噬即Ⅱ型程序性细胞死亡，发生于机体的生理或病理过程中，且与肿瘤密切相关。Beclin1是形成自噬体的必需分子，其异常表达能够促进或抑制肿瘤的发生和发展，研究表明，Beclin1表达缺失可能是甲状腺癌进展的早期分子事件[17-18]。LC3是与细胞自噬活性密切相关的基因，吕国义等[19]研究表明，Beclin1、LC3低表达与非小细胞肺癌的发生与发展紧密相关。本研究结果显示，卵巢癌组织中Beclin1、LC3 mRNA相对表达量显著低于卵巢囊肿和正常卵巢组织，卵巢囊肿组织中Beclin1、LC3基因相对表达量显著低于正常卵巢组织，且卵巢癌组织中CUZD1 mRNA表达水平与自噬相关基因Beclin 1、LC3基因表达水平呈负相关，表明CUZD1表达水平可反映卵巢癌细胞的自噬活性。

综上所述，卵巢癌组织中CUZD1表达增高，其表达水平与癌细胞增殖和侵袭活性呈正相关，与细胞自噬活性呈负相关，CUZD1可以卵巢癌诊断及病情评估的指标。