驴肠道微生物多样性及代谢功能差异分析的研究

■刘桂芹 格日乐其木格 邢敬亚 苏少锋 张心壮 曲洪磊 赵一萍 芒 来*

（1.内蒙古农业大学动物科学学院内蒙古自治区马属动物遗传育种与繁殖重点实验室农业农村部马属动物遗传育种与繁殖科学观测实验站内蒙古农业大学马属动物研究中心，内蒙古呼和浩特010018；2.聊城大学农学院山东省黑毛驴高效繁育与生态饲养工程技术研究中心山东省驴产业科技协同创新中心，山东聊城252059；3.国家胶类中药工程技术研究中心东阿阿胶股份有限公司，山东东阿252201）

近几年，随着阿胶产业发展及农业机械化，毛驴役用功能逐渐丧失，养殖模式也由原来的散养转为规模化养殖[1]。毛驴营养需要量研究目前参考马的75%进行估算，而有报道指出兔肠道产生的VFA可满足供维持能量的12%～40%[2]，驴作为单胃草食动物，肠道微生物对机体营养代谢有重要作用。草食动物利用消化道内庞大的微生物群体进行纤维素的消化，因此微生物被看作是草食动物的“消化器官”。草食动物依据消化道结构不同可分为单胃草食动物和反刍草食动物。近几年，利用高通量的宏基因组技术研究胃肠道微生物一直是热点领域，但前人研究主要集中在瘤胃[3]、盲肠[4]、粪便[5]等领域，赵文静等[6]用小鼠证明粪便微生物不能完全代表动物宿主肠道微生物的真实情况。迄今为止，对于健康驴的肠道微生物研究，只有Liu X F等(2014)[7]对粪便、方雷等[8]对盲肠和结肠固相食糜、刘宇等[9]对德州驴盲肠微生物等进行了多样性研究，这些研究均聚焦在驴的后肠环境。在马[10]、鼠[11]、鹅[12]、奶牛[13]、中国狍子等动物研究[14]中发现不同消化道微生物的多样性和丰富度存在着极显著差异。曾燕等[15]报道绵羊瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃中微生物菌群多样性呈先升后降的趋势。因此，结合驴单胃、草食的消化特性，本研究以驴前肠和后肠内容物中微生物的α-多样性、不同分类水平的优势菌群和FAPROTAX 功能预测进行研究，为了解驴消化道微生物对精饲料和饲草的消化和吸收作用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验选用2 岁左右的德州公驴5 头，屠宰后取消化道各部位内容，具体部位确定如下：胃-幽门部；十二指肠-胃结合部后10 cm；空肠-十二指肠结合部后10 cm；回肠-回盲口向前10 cm 处；盲肠-在盲肠蚓部；腹结肠-腹结肠中间部位；背结肠-背结肠中间部位；直肠-靠近肛门端。取样后在洁净条件下，取等量的胃、十二指肠、空肠和回肠内容物，，混合后定义为前肠内容物（LG）；等量盲肠、背结肠、腹结肠和直肠内容物，混合后定义为后肠内容物（UG）。将内容物放于50 ml无菌无酶冻存管封口，立即投于液氮中，运输至实验室-80 ℃保存待测。

1.2 总DNA的提取、纯化和构建文库

总DNA提取、PCR扩增及Ion S5TMXL 测序均由北京诺禾致源生物信息科技有限公司协助完成。

1.3 生物信息分析及数据处理

根据北京诺禾致源股份有限公司给出的原始序列、有效序列等信息，利用测序公司提供平台分析https：//magic.novogene.com/public/进行OTU 聚类与注释、微生物多样性及功能预测分析。

α多样性结果用SPSS 19.0 统计软件进行单因素方差分析，采用“平均数±标准差”方式表达。

2 结果

2.1 前后消化道内容物测序深度和OTU数量分析

所有样品共得到3 106 234 条有效序列，平均每个样品含（77 656±7 582）条。在不同分类水平对所得有效序列进行物种注释，共得到7 459 个OTU，属35 个门、55 个纲、118 个目、222 个科、512 个属。前肠和后肠核心OTU数为2 960个，前肠独有OUT个数为996 个，后肠独有OUT 个数为2 059 个，如图1 所示。由核心OTU 及各自特有OUT 的数量可以看出，后肠微生物的数量远高于前肠，为驴后肠消化利用饲草提供了物质基础。

2.2 前后消化道内容物稀释曲线(见图2)

由图2 样品稀释曲线可见，各曲线均趋于平缓，说明在本试验测序深度（reads=43 384）条件下，可以覆盖各样品的绝大多数微生物。由曲线的差异可以看出，前后肠达到平稳状态所需要测序深度明显不同，且前肠和后肠的分界非常明显。

图1 OTU韦恩图

2.3 前后消化道微生物群落α-多样性分析(见表1)

细菌物种的丰富度指数（Chao1、ACE、Observed species）、多样性指数（Shannon，Simpson）、系统发育多样性指数（PD_Whole_tree）等在驴前肠和后肠之间存在极显著差异（P＜0.01）；测序覆盖率指数（Goods_coverage）均达到99%，且前后肠之间没有差异。其中LG 各指数的平均数及区间如下：Chao1（989，437～2 393）、Observed species（765，338～2 014）、Shannon（4.5，2.7～8.9）、Simpson（0.85，0.5～0.99）、ACE（1 105，478-3 007)、PD_Whole_Tree（89，49～167)；UG各指数的平均数及区间如下：Chao1（1 768，377～2 299）、Observed species（1 580，257～2 118）、Shannon（8.2，3.1～9.0）、Simpson（0.98，0.78～0.99）、ACE（1 824，452～2 427)、PD_Whole_Tree（139，41～184)。

图2 样品的稀释曲线

2.4 门分类水平驴前后消化道物种相对丰度

根据物种注释的结果，为了直观的查看各消化道部位在门分类水平上最大丰度排名前10的物种及其比例，形成物种相对丰度柱形累加图见图3。由图3可以看出，在门水平上，驴前、后肠内容物均以厚壁菌门(Firmicutes)为主（占比＞50%），前肠优势菌门顺序为厚壁菌门（92.4%）、变形菌门(Proteobacteria)（3.5%）、拟杆菌门(Bacteroidetes)（2.7%）和放线菌门（Actinobacteria）（0.8%）；后肠优势菌门顺序为厚壁菌门（55.7%）、拟杆菌门（34.2%）、螺旋体门（Spirochaetes）（3.7%）和变形菌门（3.1%）。前肠和后肠厚壁菌门和拟杆菌门的比例分别为34.2:1和1.3:1。

表1 在取样深度43 384时前后肠菌群α-多样性指数分析

图3 驴门水平的腔内容物物种相对丰度图（最大丰度排名前10的物种）

2.5 属分类水平物种相对丰度

将结果中的512个属中相对丰度低于1%的菌属聚为一类，用其他表示，则前后消化道内容物微生物在属水平上的相对丰度前10物种用累积柱形表示如图4。由图4可见，在属水平上，前、后肠菌群属水平相对丰度显著不同。前肠中乳酸杆菌属（Lactobacillus）为优势菌群，约占50.1%，其次为链球菌属（Streptococcus）占21.2%、未分类的梭菌属（Clostridiales）占10.4%、放线杆菌属（Actinobacillus）占2.0%。后肠中乳杆菌属仍然为优势菌属，但占比约为5.7%，其次为链球菌属约为4.4%、未分类的旋体属（Unidentified-Spirochaetaceae）约为2.2%、未分类的梭菌属约为1.1%。相对丰度小于1%的其他菌属（Others）占比高达85.5%，这说明后肠菌群多样性非常高。

2.6 前后肠FAPROTAX功能预测

由图5功能预测PCA聚类可以清楚的发现，前肠和后肠分别聚集并区分为2类。图6揭示前肠内容物微生物功能较为简单，主要为化能异养和发酵作用，两者约占70%，后消化道也以化能异养和发酵作用为主，两者约占25%；前消化道与人和哺乳动物类似功能占比远高于后消化道。图7功能预测聚类热图可以看出，前肠和后肠的微生物功能差别明显，氮代谢、哺乳动物和人肠道功能、动物寄生虫和共生体清除功能、发酵作用、化能异养等主要集中在前肠，后肠主要为厌氧和好氧作用、氮呼吸、硫细菌、好氧复合体降解、人类传染疾病等功能。

图4 驴属水平的腔内容物物种相对丰度图（最大丰度排名前10的物种）

图6 驴前后消化道FAPROTAX功能预测柱形累积图

图7 FAPROTAX功能预测热图

3 讨论

动物肠道内的微生物不仅可以帮助机体消耗食物、抵御感染和刺激机体免疫疾病，减少患病风险。Godoy-Vitorino 等(2011)[16]等通过麝雉、牛胃及后肠微生物群落对比也发现，消化道部位(胃或后肠)是影响微生物群落的首要因素，该结论与本试验结果一致。驴具有单胃动物的消化道结构，但以草食为主，其消化道微生物与其生产生长关系密切。微生物与动物的生产性能存在密切关系，何贝贝等[17]用PCR-DEEG技术研究肠道菌群与猪的生长性能发现，DEEG 条带数量随着生长性能的提高而增多，由此也说明猪的生长性能与其肠道微生物的构成具有一定的相关性[18]，这些结果对本试验的后肠独有OUT 数量远高于前肠的结果解释后肠消化利用粗饲料奠定了基础。

本研究发现，在菌门和菌属水平上均表明后肠样品间的菌群相似性大于前肠样品间的相似性，其α-多样性的shannon指数与Ericsson等(2016)[19]对健康马的研究结果基本相符，后肠的多样性指数极显著的高于前肠。这可能是在胃酸的作用下，前肠环境不稳定；而后肠结构比较封闭，在功能上也更类似，所以其相似性也更高。Ley E等（2008）[20]报道人胃与肠内微生物不同，包括细菌、古细菌、真菌等，其中细菌占主导地位，优势菌群为厚壁菌门和拟杆菌门，两者占比超过98%。同时，也有报道指出马[21]、牛[22]、猪[23]等中其胃肠道优势菌群均为厚壁菌门、拟杆菌门，兔盲肠优势菌门顺序依次为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和疣微菌门[24]，刘宇等（2019）[9]发现德州驴盲肠菌群优势顺序为厚壁菌门、拟杆菌门、微疣菌门和螺旋体门。本研究发现驴前肠优势菌门顺序为厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门；后肠为厚壁菌门、拟杆菌门、螺旋体门和变形菌门。报道发现草食动物利用碳水化合物的主要菌群为厚壁菌门微生物[25]，而拟杆菌门则是草食动物分解纤维素的主要菌群[26]，这两种菌在前后肠微生物中的相对丰度占比，很好的说明后肠是驴耐粗饲的基础[27]。

菌属水平上，本研究发现前肠中以乳杆菌属为主；后肠主要为丰度小于1%的菌属，丰度最高菌属为瘤胃疣微菌属（盲肠以螺旋体属为主）。乳杆菌属多为有益菌，对酸的耐受强，可以选择的杀死病源微生物。瘤胃疣微菌属与纤维降解密切相关，可产生纤维酶降解纤维二糖等纤维类物质，属于典型的纤维降解菌[28-29]。Patra等[30]和Zhao等[31]均证明瘤胃菌科微生物的数量与纤维素消化利用存在密切关系。由此可以看出，驴后肠具有极强的纤维素分解微生物基础，可以很好的解释其耐粗饲的原因。

FAPROTAX 是基于目前对可培养菌的文献资料手动整理的原核功能注释数据库。本试验发现，前肠内容物微生物功能主要为化能异养和发酵作用，而后消化道亦以化能异养和发酵作用为主，但占比由75%下降至25%，同时，氮代谢、哺乳动物和人肠道功能、动物寄生虫和共生体清除功能、发酵作用、化能异养等主要集中在前肠，后肠主要为厌氧和好氧作用、氮呼吸、硫细菌、好氧复合体降解、人类传染疾病等功能。这一结论与Dibaise 等（2008）[32]报道前消化道部位主要依靠机体消化酶进行营养物质的消化吸收，而消化道尤其是盲肠和结肠与微生物发酵有关的结论一致。同时，这一结论与微生物类群分布及其功能完全吻合。

4 结论

本研究基于16S rRNA高通量测序技术对驴前后肠内容物肠道菌群组成多样性和功能预测进行了分析。本研究得到如下结论：①驴前后肠部位菌群多样性和丰富度差别极显著；②后肠部位内容物菌群丰富度和多样性高于前肠，具有发酵纤维素的疣微菌属等菌群基础；③前肠微生物主要具有氮代谢、动物寄生虫和共生体清除功能、发酵作用等功能，后肠主要为厌氧和好氧作用、氮呼吸、硫细菌等功能。这一结果从微生物方面，为驴营养代谢及科学的饲养管理提供理论支持。