药用植物内生菌的多样性及其活性代谢产物功能研究进展

黄 磊 高燕燕 许才万 曾亚军*

(1 贵州省林业科学研究院 贵阳 550005；2 贵州大学生命科学学院 贵阳 550025)

近年来，受国内外研究者的持续关注，植物内生菌已成为多个领域研究中的热点，它存在于植物的健康组织内并与宿主互惠共生、协同进化，是一类形态种类各异的微生物类群。然而由于研究者的研究角度不同，对植物内生菌定义的概念也有所不同。国际上对植物内生菌的界定，尚有不同的意见，De Bary于1866年的定义是：生活在植物体组织内的所有生物体，包括内生真菌、内生细菌和放线菌等微生物，用于区别生活在植物组织表面的表生物(Epiphyte)[1]，Bacon于1988年、Petrini于1991年将其定义为：只要来自外表健康的植物体内的真菌或细菌即内生菌[2～3]，国际植物病理学会于1998年对其定义：在植物体内完成其生活史的部分或全部,但又不引起任何病症的微生物[4]，这次的定义已经着重关注内生菌在宿主体内的生活史。目前，业界普遍认为植物内生菌(Endophytes)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物不同组织和器官的内生真菌或细菌，被感染的宿主植物不表现出外在症状[5]。

植物内生菌在植物生命过程中有着着重要的作用，自Vogl于1898年成功从黑麦草(Loliumtumelentum)的种子中分离得到第一株内生真菌以来[6]，已有越来越多的科研工作者从不同植物中分离得到不同种类的植物内生菌。多年来，不同研究领域的众多研究成果既丰富了内生菌种类，也加深了我们对内生菌的认识。植物内生菌作为一种重要的微生物资源，是新型天然活性物质的重要来源之一，不但可以产生萜类、黄酮类、内酯类、酚类、多肽类等与宿主植物相类似的生物活性物质[7～8]；而且对植物生长发育、次生代谢、应对生物胁迫等方面也具有重要作用[9]。目前已有数百种植物内生菌的相关研究，本文主要回顾国内外部分药用植物内生菌的多样性及其活性代谢产物的应用研究。

1 植物内生菌的多样性

1.1 内生菌在植物中分布的多样性

植物内生菌在植物中的分布具有多样性，它分布于大部分植物组织中，尤以植物表皮下的组织中居多，近几十年来，已从不同植物的茎、种子、胚珠、胚根、叶及其它植物储藏器官内分离得到大量内生菌，从针叶植物、草本植物、栽培植物、蕨类植物的树皮、枝叶、根、原球茎中均成功分离得到内生菌[10～11]，可见植物内生菌的分布部位趋于多样化。柴晓蕾等[12]以海南特有药用植物华石斛野生植株为材料，从其根、茎、叶中分离获得不同种属内生菌，发现叶中分离的菌株数最多，有些类群具有一定的组织偏好性。

一般而言，在植物生长的不同阶段，其内生菌种类也具有差异，因此分离内生菌时可根据试验目的选择不同生长时期的植物。如兰科具有较高的观赏和药用价值，虽然从成年植物根、茎、叶中能够分离得到多种内生菌，但从中分离得到的内生菌常常不能促进种子萌发，许多科研人员正尝试从原球茎中分离促进种子萌发的内生菌。

1.2 植物内生菌种类的多样性

植物内生菌种类繁多，并在各种陆生、水生低等植物和高等植物中广泛分布，种类主要包括内生真菌、细菌和放线菌[13～14]。研究表明，植物内生菌种类和分布在不同地域、不同宿主植物、不同组织部位中具有较大差异。筛选分离植物内生菌步骤基本分为：消毒、清洗、接种、培养、分离。其中，消毒可以考虑使用医用酒精、双氧水、适当浓度次氯酸钠等表面消毒剂对其组织进行消毒；随后用无菌水冲洗组织表面；消毒彻底后接种于平板中；根据不同的内生菌种类选择适宜条件进行培养；根据条件按不同菌落进行分离。

1.2.1 植物内生细菌存在多样性

内生细菌种类具有多样性，分离普遍采用牛肉膏蛋白胨培养基。自20世纪中叶起，国外就已经在多种植物中分离得到不同种属的内生细菌。我国在植物内生菌领域研究虽然起步较晚，但也有研究者从番茄、棉花、富贵竹、辣椒、哈密瓜、马尾松、烟草等不同植物中分离得到多种内生细菌，包括芽孢杆菌属(Bacillus)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)及短小杆菌属(Cutrobacterium)等不同菌属，其中芽孢杆菌属的菌株在多种植物中均有发现[15]。研究人员统计发现，植物内生细菌在根部及种子中的含量相对高，在茎和叶中相对较少。

曾庆桂等[16]对珍贵药用蕨类植物蛇足石杉(Huperzia serrate)内生菌进行了研究，筛选得到一株能够拮抗小麦赤霉等植物病害真菌的内生细菌，结合形态学、生理生化以及16S rDNA分子鉴定，初步鉴定为属伯克霍尔德属，与常用的生防菌洋葱伯克霍尔德菌亲缘关系较远，将其命名为Burkholderiasp.H-6。方晓梅等[17]采用不同培养基从蜘蛛抱蛋属植物中分离得到156株内生细菌，结合16S rRNA进行进化树分析显示分属于3门10目22科29属，且23.7%的细菌具有抑菌活性。

1.2.2 植物内生真菌存在多样性

内生真菌种类具有多样性，分离多采用马铃薯固体培养基。大多数植物内生真菌属于子囊菌(Ascomycetes)、盘菌纲(Discomyetes)和腔菌纲(Loculoascomyete)的部分属种以及一些近源菌。目前已报道的药用植物内生真菌主要包括镰刀菌属、交链菌属、青霉属、根霉属、芽枝霉属、毛壳菌属等，其种类十分丰富。据不完全统计，已在80多个属的几百种禾本科植物中发现了内生真菌[18]。

植物内生真菌能够产生酚、萜类、黄酮类等代谢产物，表现为抗肿瘤、抗氧化等不同生物活性。Min Q等[19]从银杏中分离出的两种内生真菌能够产生酚类和黄酮类化合物，通过形态学分析判断这两株真菌都属于曲霉属，进一步采用分子手段对ITS1-5.8SITS2区域的分析鉴定了这两株菌分别为Aspergillusnidulans和Aspergillusoryzae。华梅等[7]采用组织块分离法从白木香(Aquilariasinensis(Lour.) Gilg.)茎秆及叶片中分离获得对常见致病细菌具有明显抑制活性的10株内生真菌，其中A. rasikravindrii，Diaporthesp.,P. amygdali,Phomopsissp.,P. macrospinosa这5株是首次从该物种中分离得到。将传统的微生物鉴定方法与分子生物学手段相结合，能够大大提高微生物鉴定的可靠性，部分未知的新种也能够被成功鉴定，为生物资源的多样性补充新的种类。

1.2.3 植物内生放线菌存在多样性

内生放线菌种类具有多样性，分离多采用丙酸钠、琥珀酸钠等培养基。植物内生放线菌中研究较多的是非弗兰克氏菌属的内生固氮放线菌，其余绝大多数为链霉菌属(Streptomyces)，其次是小双胞菌属(Microbispora)、小单孢菌属(Micromonospora)、诺卡氏菌属(Nocardia)、链孢囊菌属(Streptosporangium)。Uvidello F.Casitillo等[20]从巴塔哥尼亚南部的假山毛榉和其他植物中分离出的内生放线菌经16S rRNA序列分析鉴定，发现这些放线菌与GenBank中报道的其他放线菌具有明显差异，这证明了植物体内存在大量的不同的内生放线菌。

2 植物内生菌活性代谢产物及其功能

2.1 内生菌活性代谢产物种类

植物内生菌活性代谢产物种类丰富，主要有萜类、生物碱、皂苷类、芳香类、多肽类等，其中很多代谢产物对人类疾病有很好的疗效，另外内生菌在植物资源保护的开发与应用也具有重要作用，尤其有助于兰科等珍稀濒危物种的保护与开发利用。

表1 文献已报道的内生菌部分活性代谢产物

2.2 内生菌活性代谢产物的应用

内生菌活性代谢产物具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗虫等活性，在医药、农药、育种等领域有巨大的实用价值和广阔的应用前景。

2.2.1 抗肿瘤类活性物质

药用植物内生菌的活性代谢产物种类繁多，具有抗肿瘤作用主要包含萜类化合物(紫杉醇、紫杉烷等)、生物碱类化合物(长春新碱、细胞松弛素等)、苯丙素类化合物、黄酮类化合物等多种活性物质。紫杉醇属于萜类化合物，以极低含量存在于不同紫杉醇属植物树皮和树叶中，作为天然抗癌药物之一，对卵巢癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、直肠癌等均有疗效。方美娟等[21]通过X线单晶衍射、薄层色谱扫描(TLC)和核磁共振等方法确认南方红豆杉、榧树和杉木内生菌的代谢产物中含有BFA活性成分，并具有良好的抗肿瘤效果。李俊峰等[22]采用乙酸乙酯提取检测铁皮石斛内生菌TG2代谢产物，经MTT法检测发现其代谢产物对肿瘤具有良好抑制效果。

长春碱(Vinblastine)为生物碱，最初从夹竹桃科植物长春花中提取，对治疗白血病有明显作用。现已发现从长春花组织中分离出的内生菌也能产生长春碱及其衍生物。张玲琪等[23]通过薄层色谱扫描法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)证明长春花的内生真菌尖镰孢(Fusariumoxysporum)可以产生该类物质，大大减少了使用局限性。直接从植物种提取活性物质，不仅量少且成本高，若能直接从内生菌中提取与宿主具有相似活性的物质，能够大大提高实用价值减少研发成本。

2.2.2 抗菌类活性物质

植物内生菌的活性代谢产物功能多样化，对人类感染的细菌和真菌具有拮抗作用，从天然产物中获得抗菌物质一直以来都是研究热点。早期由于技术局限，大多数时候只能通过传统方法分离得到一些代谢产物，进行简单的结构分析及理化性质检测。目前已能够采用先进的分子生物学技术对内生菌产生的活性物质进行结构分析，为更深入的揭示物质结构及功能分析提供基础。王伟等[24]从核桃的根、茎、叶、果中分离出的内生真菌能够产生多种具有拮抗活性和化感作用的次生代谢产物，可以作为上述活性物质的筛选材料。另外，一些新的抗菌素也已从植物内生菌中筛选分离出，如抗菌素Fistupyrone、三萜糖苷类抗菌素等。

2.2.3 抗氧化类物质

抗氧化作用也是部分植物内生菌的重要生物活性之一，如杜仲内生真菌Chaetomellasp.产生的黄酮类物质，植物类弯胞属内生真菌产生的苯并吡喃以及九里香正青霉属内生真菌的生物碱类物质Spiroquinazoline alkaloid等都具有明显的抗氧化的作用[25]。

2.2.4 抗病毒类活性物质

樊兵，吴云峰[26～27]等从独活、红藻、天竺葵等植物中分离出的部分内生菌对烟草花叶病毒具有较好的抑制作用。由于病毒是农作物、经济作物的主要病害，用化学药物喷施防治会给生态环境造成较大危害，科研人员已发现部分内生菌代谢产物具有抗病毒活性，所以开发更多的微生物代谢产物来防治植物病毒害是一种有效途径。

2.2.5 促进植物生长发育

植株感染内生菌的影响可以在其生长发育方面表现出来，内生菌对植物的幼苗生长、种子萌发具有较好的促进作用[28～29]。主要在种子萌发、分蘖生长、幼苗存活、植株的高重和生长势、生物累积等多方面出现差异性[30]。植物内生菌对其生长发育的影响主要通过以下四方面作用：

①产生植物生长素、赤霉素以及细胞分裂素等代谢产物促进植物生长。

②从周围环境中吸收或真菌菌丝消化释放C、N、P等营养物质满足植物生长需要，直接促进植物的生长。

③通过与病原菌竞争营养、空间，或直接产生一些拮抗物质抑制病原菌生长，间接促进植物生长[31]。如胶膜菌属、假单胞菌属、蜡核菌属等都能产生吲哚乙酸或赤霉素，还有部分内生菌不仅能产生吲哚乙酸，而且还能产生细胞分裂素(如草生欧文氏菌)，这些物质都能有效促进植物的生长[32]。

④通过改变根部周围的环境来缓解非生物压力，如分泌胞外多糖来改变土壤结构，改变生长环境的pH值 从而增加植物根部对环境的适应性，促进植物生长[33]。史应武等[34]发现从甜菜根部分离的1株内生菌能显著增加甜菜鲜重、叶绿素含量及含糖率，有明显的促生、增糖作用。

2.2.6 固氮作用

Chen等[35]用来自棉花的内生细菌回接棉花，可以减轻人工接种感染的棉花枯萎症状。科研人员很早就提出了豆科植物-根瘤菌共生固氮体系，而内生菌与非豆科植物的固氮作用是在Dobereiner等[36]于1975年从甘蔗分离出内生固氮螺菌、并提出联合固氮概念后才开始引起关注。

2.2.7 增强植物抗逆性

植物感染内生菌与否，对植物的抗逆性表现不同，内生菌可以增强植株对逆境的适应性。例如：

①在非生物胁迫方面，感染内生菌的植物对环境胁迫如干旱、盐碱具有更强的抗性。盐生植物滨麦[Leymusmollis(Trin.) Hara]能够与黄色镰刀菌共生，而镰刀菌能够协助宿主抵抗高盐环境，使滨麦具有耐高盐环境的特性[37～38]。Cui JL等[39]筛选出的内生菌在低海拔环境下能够保证红景天正常发育并提高其天苷和酪醇的产量。

②在生物胁迫方面，感染内生菌的植株可阻止其他昆虫和食草动物的采食、抗病毒虫害。科研人员从植物中分离出的内生菌制成菌剂，注入同种植物或不同种类植物中，能够很好的抵抗病虫害。

2.2.8 作为生防因子应用

植物内生菌可以作为生防因子，由此思路可以开发出一些植物生防菌剂。

3 结论及展望

近年来，医学、中药学、生态学、微生物学、植物病理学的专家学者对植物内生菌的相关研究已越来越关注。其活性代谢产物种类繁多、结构新颖、作用方式多样，是一条寻找更多新的生物活性物质的有效途径；同时也为天然药物的开发和应用提供了便利。由于药用植物内生菌产生的活性代谢产物具有不同的药用功能，可以考虑结合基因工程、蛋白质工程、生物化学与分子生物学等技术手段培养可以产特异性活性代谢产物的菌株，大量生产并制备具有治疗效果的微生物代谢产物，这样可以极大的提高内生菌的利用利率，降低生产成本，但是如何找到适宜的技术体系是个难题。

由于植物种类多种多样，存在于其组织内的内生菌自然也极其丰富，这是一个珍贵和极具开发潜力的微生物资源宝库。但植物内生菌在植物体内分布存在种属特异性、组织偏好性、地区差异性等多方面因素，因此对这一天然微生物资源的开发和利用尚有很多不足之处，目前已开发的资源还较少，合理开发利用植物内生菌资源，寻找新的活性物质，在今后的研究中将更受关注。当然，在植物内生菌资源的开发利用方面还有很大的提升空间，如何精准、简单、高效的分离内生菌是一个亟待解决的问题。一般情况下，植物内生菌次级代谢产物含量较少且分离纯化困难，有时难以完成结果鉴定和活性测定的所有流程，因此，寻找可靠、有效的方法提高获得内生菌次级代谢产物含量是目前迫切需要解决的问题之一。

此外，由于大多数植物都需要与内生菌共生，但在共生过程中，内生菌究竟发挥什么作用、以何种方式发挥作用，一直是困扰学术界的大问题，这就是宿主-微生物之间的互作关系。更好的了解宿主-微生物间的共生机制，深入研究植物内生菌与宿主之间的互作关系必然引起越来越多科研人员的兴趣，从而成为今后的热点问题。