低分子有机酸对土壤中菲降解及细菌群落结构的影响

王姣龙,谌小勇,2,4,闫文德,2,3,*

1 中南林业科技大学,长沙 410004 2 南方林业生态应用技术国家工程实验室,长沙 410004 3 城市森林生态湖南省重点实验室,长沙 410004 4州长州立大学,伊利诺伊州 IL 60484

多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是一类广泛存在于环境中的具有致癌、致畸、致突变性的持久性有机污染物,主要来源于人类活动,例如汽车尾气、化石燃料不完全燃烧等[1],可通过大气、水体、土壤和植物间的传输和交换而在整个环境中分布,并经过食物链进入动物体和人体,直接威胁包括人类在内的生命有机体的健康和安全[2]。因此,揭示PAHs在环境中的动态机制,加快对PAHs的清除速度,对于环境质量改善和国土安全具有重要的现实意义。

添加模拟根系分泌物是一项很有发展前途的新型的PAHs污染土壤的生物修复技术,其原理是通过调节和改变土壤微生物群落的结构和活性促进PAHs的降解[3]。微生物降解土壤中的PAHs一般有两种方式,一种是以PAHs为唯一碳源和能源；另一种是将PAHs与其他有机质进行共代谢作用。据报道[4],根系分泌物中的一些低分子有机酸,比如琥珀酸和苹果酸能够有效促进吸附在土壤上的菲和芘的解吸,提高土壤中PAHs的有效性,从而加快PAHs的降解。土壤中有机质含量越低,解吸作用越明显。且不同分子量的外加碳源组分均在一定程度上缩短细菌对芘进入快速降解期的时间[5]。不同低分子有机酸对PAHs降解的影响作用不同,Wei等[6]发现在液体培养下,丁酸对混合PAHs(芴、菲、芘)降解效果优于苹果酸和柠檬酸,其主要是极性较弱的丁酸可优化表面疏水性较强的分支杆菌与疏水性PAHs的接触。

在我们前期的研究中发现,植物根系分泌物种类繁多。在PAHs胁迫下,根系分泌物中的物质组成发生改变[7-8]。作为利用植物根系分泌物对PAHs污染土壤修复技术研究项目的一部分,本研究通过高通量Illumina Miseq技术,重点研究根系分泌物中低分子有机酸对土壤中菲的降解过程,并探讨添加低分子有机酸后菲污染土壤中细菌群落种类和数量的变化特征,揭示植物根系分泌物对PAHs污染土壤中微生物群落结构的影响,以期为进一步研发PAHs污染环境下的植物-微生物联合修复技术提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试土壤采自于中南林业科技大学校园东园苗圃表层土壤(0—20 cm)。将供试土壤捡出根系、石块等残留物,自然风干后过2 mm筛子。采用酸度计测定土壤的 pH 值(水土比 5∶1)；采用岛津总有机碳测定仪测定土壤总有机碳含量,采用凯氏蒸馏法测定土壤全N含量,采用硫酸-高氯酸消煮法测定土壤全P含量。经测定,供试土壤的基本理化性质：土壤pH值为5.40,土壤总有机碳含量为5.02 g/kg,土壤全N含量为0.13 g/kg,土壤全P含量为0.22 g/kg。

菲污染土壤的制备：选用菲(>97%,购于Sigma-Aldrich Co.)作为供试污染源,菲是PAHs中3个苯环的代表物,在环境中广泛存在,是检测PAH污染的指示物。将菲溶于丙酮后倒入供试土壤中均匀混合,制得2000 mg/kg水平的菲污染土壤,置于盆钵中平衡7 d后备用。

取500 g菲污染土壤盛装于500 mL烧杯中,烧杯外壁裹上锡箔纸,模拟土壤黑暗状态,分别加入30 mL 0.16 mol/L乙酸、柠檬酸、酒石酸、草酸、混合有机酸(乙酸、柠檬酸、酒石酸及草酸的混合液)溶液,搅拌均匀后放置在温室中,贴好标签。同时设置对照处理,即在500 g污染土壤的烧杯中加入30 mL的去离子水,形成6种不同的处理：对照处理(K)、乙酸处理(Y)、柠檬酸处理(N)、酒石酸处理(J)、草酸处理(C)、混合有机酸处理(H)。每个处理有3个重复。实验历时180 d,实验期间烧杯随意摆放,每月将烧杯位置随机移动一次,尽量使每个烧杯的微环境保持一致,室内温度因开窗对流基本与环境温度保持一致。实验分别于0、60、90、180 d后,采样。

1.2 研究方法

土壤中菲的提取和净化：取5 g制备好的土壤样品于聚乙烯杯中,加入50 mL甲醇后,震荡5 min,超声20 min,4000 r/min离心25 min,取上清液过0.45 μm孔径聚丙烯纤维滤膜,将稀释液过SPE萃取柱,10 mL乙腈洗脱,取1 mL洗脱液过0.45 μm孔径滤膜后上气质联用仪分析。

气质联用仪测定条件：流量1 mL/min,进样口温度230 ℃,接口温度280,60 ℃→15 ℃/min→100 ℃(5 min)→8 ℃/min→210 ℃(3 min)→2 ℃/min→290 ℃(5 min)。

色谱柱为HP- 5毛细管色谱柱30 m×0.25 mm。不分流进样,气化温度280 ℃,载气为高纯He。

细菌16S rRNA 基因高通量测序[9]：测序由上海美吉生物工程技术服务有限公司完成,采用Illlumina Miseq系统进行双向测序,采用引物515 F和907 R扩增细菌16S rRNA基因片段。测序所得结果,采用prinseq软件对reads1、reads2的3端进行质控,截掉质量低的数据,以提高后续序列融合比率。通过Flash 软件融合双末端序列,使其形成一条序列。采用prinseq软件对各个样品进行去引物序列、短片段、低复杂度序列、低质量序列。

1.3 数据分析

数据输入整理及作图采用Excel 2010软件；采用SPSS 18.0对土壤理化数据进行方差分析、多重比较,使用R语言分析微生物多样性数据。

2 结果与分析

2.1 不同处理下土壤中菲的降解过程

图1 不同处理水平下土壤中菲降解Fig.1 Degradation of Phenanthrene in soil at different levels

由图1可知,随着时间的推移,对照组土壤中菲会自然降解,添加低分子有机酸对土壤中菲的降解有一定的促进作用,第0天土壤中菲含量均为571.46 mg/kg,第60天,菲含量降到了：210.70—340.39 mg/kg,降解率为：乙酸(63.13%)>柠檬酸(49.30%)>草酸(49.27%)>酒石酸(49.13%)>混合有机酸(43.28%)>对照(40.44%)；第90天,菲含量为：208.65—321.55mg/kg,降解率为：乙酸(63.49%)>柠檬酸(53.96%)>混合有机酸(51.83%)>草酸(51.72%)>酒石酸(50.45%)>对照(43.73%)。第180天,菲含量为：175.28—306.07 mg/kg,降解率分别为：乙酸(69.33%)>混合有机酸(57.41%)>草酸(56.15%)>柠檬酸(54.98%)>酒石酸(52.30%)>对照(46.44%)。用一级动力学方程对不同处理下菲降解过程进行了拟合(表1),结果表明,相较于对照,添加低分子有机酸的组分动力学常数增大,半衰期缩短,由动力学常数得出乙酸对菲降解的促进作用最为明显。

表1 不同处理水平下菲的一级降解动力学方程

K：对照，Y：添加乙酸，N：添加柠檬酸，J：添加酒石酸，C：添加草酸，H：添加混合有机酸

2.2 菌群群落结构组成

18个土壤样品中细菌分布在12个门,24个纲,42个目,50个科,61个属,61个种。序列中不能识别的分在其他组中。

在门分类水平下(图2示),6个处理中,变形菌门、厚壁菌门、酸杆菌门、放线菌门、绿弯菌门、浮霉菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门、装甲菌门、GAL15、硝化螺旋菌门、Latescibacteria为优势门类,丰度占比90%以上。变形菌门是细菌中最大的一门,包括了假单胞菌属、产碱杆菌属等多种环芳烃降解菌属,所有处理中变形菌门丰度均为最大,占所有组细菌门类的70.39%,添加低分子有机酸的组分中变形菌门丰度明显高于对照组,其中乙酸组变形菌门丰度占比在第60天(71.57%)和第180天(93.46%)时最大,混合有机酸占比在第90天(93.7%)时最大(图3示)。

图2 门水平细菌群落结构分布Fig.2 Bacteria community structure and distribution at phylum levelK：对照，Y：添加乙酸，N：添加柠檬酸，J：添加酒石酸，C：添加草酸，H：添加混合有机酸

图3 不同时期变形菌门丰度分布图 Fig.3 Distribution of Proteobacteria abundance at different stages

在属分类水平下(图4示),6个处理中,产黄杆菌属(Rhodanobacter)、Fimicutes、Acidobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria、Bacteroidetes、Gemmatimonadetes、Planctomycetes、Amatimonadetes、GAL15为优势菌属,丰度占比90%以上。以丰度占比最大的产黄杆菌属为例,产黄杆菌属具有一定的多环芳烃降解能力[10],添加低分子有机酸的组分中产黄杆菌属丰度明显高于对照组(图4示),第60天时柠檬酸组丰度占比(30.69%)最大,第90天时酒石酸组最大(49.37%),第180天时乙酸组最大(41.22%)。在第60天、第90天及第180天还检测到了5种典型的菲降解菌,分别为：Bacillus[11]、鞘氨醇单胞菌属[12]、Massilia[13]、Azospirillum[14]、Burkholderia-paraburkholderia[15]。5种典型菲降解菌均呈现出添加低分子有机酸组丰度占比高于对照组,且随时间推移丰度占比升高。在第60天和第180天检测到了一种PAHs降解菌红球菌[11]。

2.3 菌群丰度变化和多样性分析

OTU数是通过聚类操作得到的具有相似性的序列小组,可代表物种数目。由表2知,共检测到648795条有效序列和565127个OTU。不同处理之间,OTU数量存在较大差异,第60天,对照组中OTU数明显高于其他组,排序为对照>混合有机酸>乙酸>草酸>酒石酸>柠檬酸；第90天,排序为：草酸>柠檬酸>对照>乙酸>酒石酸>混合有机酸；第180天,对照>乙酸>混合有机酸>柠檬酸>草酸>酒石酸。不同采样时间之间也存在差异,随着时间推移土壤中总OTU数呈现下降趋势,分别为：60天(OTU总数为197084)>90天(184663)>180天(183380)。

表2 不同处理水平下的测序结果和丰度变化

对不同处理水平下的土壤进行Alaha多样性分析,用Ace指数和Chao指数表示土壤中菌群丰度水平,用香农指数和辛普森指数表示菌群多样性。结果显示,在第60天、第90天和第180天,Ace指数和Chao指数均呈现出对照组菌群丰度水平高于其他添酸组,香农指数和辛普森指数也显示出对照组菌群多样性高于其他添酸组,这说明添加低分子有机酸降低了菲污染土壤中细菌丰度及多样性。在添加了低分子有机酸的组分中,第60天和第90天时酒石酸组细菌丰度及多样性较高,第180天时混合有机酸组较高。

图4 属水平细菌群落结构分布Fig.4 Bacteria community structure and distribution at genus level

图5 不同时期产黄杆菌属丰度分布图Fig.5 Distribution of Rhodanobacter abundance at different stages

2.4 细菌群落结构的相关性分析

用主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)的方法鉴别不同处理中细菌群落结构差异。由图6示,在OTU水平下进行了主成分分析,在第60、90、180天,对照组与其他添加低分子有机酸的组分相关性不明显。在第180天,添加草酸和柠檬酸组中OTU组成高度相似。其余不同时期不同组分之间相似度不高。

图6 细菌群落的主成分分析Fig.6 Principal component analysis of bacterial community

2.5 细菌群落结构的差异性分析

由图7示,用Venn图来表示不同时期细菌群落结构的差异性。第60天、第90天、第180天测得的OTU种类数分别为：2680、2705、2542；其中共有OTU种类(1911),占3个时期总OTU种类数(3370)的56.71%；第60天、第90天、第180天独有的OTU数分别为233(占总OTU种类数比例为6.91%)、292(8.66%)、199(5.91%)。第60天、第90天、第180天测得的属种类分别为：530、560、540；其中共有属种类(446),占3个时期总属种类数(656)的67.99%,独有的属数分别为26(占总属种类数比例为3.96%)、66(10.06%)、36(5.49%)。第60天、第90天、第180天测得的门种类分别为：31、33、28；其中共有门的种类(28),占3个时期总门种类数(35)的80.00%,独有的门数分别为2(占总门种类数比例为5.71%)、4(11.42%)、0(0.00)。在门水平、属水平和OUT水平下,第60天至第180天之间独有种类数均呈现出先增长后下降的趋势,说明了不同处理之间在第90天时细菌菌群差异性最大。

图7 细菌群落结构的Venn图Fig.7 Venn drawing of bacterial community structure

3 讨论与结论

目前,利用植物-微生物复合体系降解多环芳烃污染物已有一些报道[16],但植物根系分泌物对植物-微生物复合体系降解多环芳烃的影响研究较少。本研究验证了添加根系分泌物促进了菲的降解,通过研究土壤中细菌群落特征,深入分析了根系分泌物降解菲的机理,为PAHs污染修复提供了科学数据。

菲污染土壤自身有一定的修复能力,但低分子有机酸对于土壤中菲的降解有明显的促进作用。低分子有机酸促进土壤中多环芳烃的降解主要因为提供了碳源促进了多环芳烃降解菌的生长,不同低分子有机酸提供的碳含量存在差异,超过一定浓度时会对土壤中的微生物产生抑制作用[17],因此不同低分子有机酸对多环芳烃降解的促进作用不同。本研究中,通过计算一级动力学方程得出乙酸组对菲降解的促进作用强于其他组分,乙酸有应用于土壤修复治理的潜力,这可能是由于菲降解菌对不同种类低分子有机酸利用率不同,也可能由于不同种类低分子有机酸对土壤理化性质影响存在差异,添加低分子有机酸会导致土壤pH值降低,影响了土壤微生物群落结构,具体原因有待进一步分析。

通过高通量Illumina Miseq技术综合评价了土壤细菌群落特征,得出从细菌群落结构来看,土壤细菌的数量及其多样性或许不是导致土壤菲降解的主要因素,反而特定的菲降解菌的丰度对菲降解有重要影响。这有可能是低分子有机酸仅为土壤中某些特定的微生物群落提供了碳源,促进了特定微生物的增长,并不一定会增加微生物总量及多样性。王悦等[18]研究了三叶草根系分泌物对多环芳烃微生物降解及加氧酶的影响,得出三叶草根系分泌物促进了分枝杆菌M1加氧酶基因拷贝数的增长,却未明显引起16S rDNA基因数的增加。这说明了微生物数量及多样性并不是反映微生物降解多环芳烃能力的敏感指标。添酸组中变形菌门丰度明显高于对照组,且检测到的5种典型的菲降解菌(分别为：Bacillus[11]、鞘氨醇单胞菌属[12]、Massilia[13]、Azospirillum[14]、Burkholderia-paraburkholderia[15])的丰度占比在添酸组中明显高于对照组,通过PCA分析也证明了对照组和其他添酸组的细菌菌群存在差异性。可能是因为菲降解菌丰度的增加促进了菲的降解,也可能与土壤理化性质有关,具体机制有待进一步研究。

添加低分子有机酸处理下不同时期土壤中细菌存在差异,随着时间推移土壤中总OTU数呈现下降趋势,有可能是土壤中碳源随时间减少,造成了土壤中OTU总数的减少。根据共代谢(Cometabolism)作用原理,也有可能是低分子有机酸的存在,增强了菲降解菌的酶活性,提高了菲降解菌对非生长基的降解效率。从细菌群落结构Venn图可以看出,添加低分子有机酸影响了PAHs污染土壤中细菌群落结构组成,在第90天时细菌菌群差异性最大,这与众多学者的研究结果一致[19-20],说明随着时间推移,土壤中菲含量下降,引起了细菌多样性先增长后下降的改变[21-22]。