雌激素对一氧化碳中毒迟发型脑病大鼠海马的影响

明 利，辜刚凤，红 艳，雷蕊绮，蒋 力，李经伦

(1.成都天府新区人民医院神经内科，四川 成都 610213；2.西南医科大学临床医学院，四川 泸州 646000；3.西南医科大学附属医院神经内科，四川 泸州 646000)

一氧化碳(CO)中毒是最为常见的致命性空气中毒，因其神经损害严重，临床症状多且复杂，治疗及预后不佳，造成了一系列严重的健康问题[1]。部分患者在发生CO中毒症状恢复后经过约2周左右的无症状期后，可出一系列神经系统症状和体征，主要为表现为记忆、认知功能、内脏自主神经系统功能障碍等，称为急性CO中毒迟发性脑病(DEACMP)[2]。雌激素是人体内常见甾体类固醇激素，具有抗氧化应激、抑制细胞凋亡、改善线粒体功能、协调神经营养因子表达等功能[3]。在阿尔茨海默病、帕金森病等神经系统疾病中具有一定的保护作用。胡慧军等在CO中毒迟发型脑病临床实验中发现，在相同的中毒环境下，绝经前女性中毒程度更轻、预后更好，并首次提出女性生殖激素可能在CO中毒后的脑损伤中具有保护作用[4]。髓鞘碱性蛋白(MBP)及髓过氧化物酶(MPO)与多种神经系统疾病的发生密切相关，可作为炎症、应激指标评估神经系统损伤的程度。本文探讨雌激素在CO中毒迟发性脑病中的作用，在实验中建立了DEACMP大鼠模型，测定雌激素在DEACMP中对大鼠血清 MBP、MPO的表达影响，为雌激素在CO中毒迟发型脑病的临床治疗中提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组2017年10月，西南医科大学选用雄性SD鼠(250-300 g)72只随机分为空气组、CO组和雌激素组，每组各设置3个亚组，每个亚组8只大鼠。大鼠由西南医科大学动物中心提供，饲养在恒温干净的房间，温度(22±2) ℃，设置为12 h光暗周期。

1.2 急性CO中毒大鼠模型的制作及检测将实验大鼠按首剂100 ml/kg腹腔注射CO气体，后分别间隔4、8、12小时追加注射首剂的一半。随后随机抽取每个亚组大鼠1只，分别于染毒前及首次染毒后15 min及每隔两小时至20 h时分别取鼠尾静脉血0.5 ml血气分析测定HbCO浓度。于造模结束后，雌激素组大鼠每天9：00-10：00时皮下注射溶有10 μg 17β一雌二醇的0.1 ml大豆油。CO组空气组和对照组皮下注射0.1 ml大豆油，直至处死。

1.3 Morris水迷宫将水迷宫放在避光避声的房间，水温保持在(20±1) ℃。大鼠每天训练2次，设定最长游动时限为120秒，以记录大鼠找到平台时间称逃避潜伏期。考虑大鼠中毒后短时间内不能进行水迷宫实验，我们的水迷宫实验选择造模前及从第3天开始进行，因严重急性CO中毒会导致大鼠无法进行水迷宫试验的大鼠将被淘汰。训练6天，第7天正式进行定位导航和空间探索，造模前淘汰有认知功能障碍大鼠，造模后筛查出发生迟发型脑病大鼠并做标记。

1.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)在大鼠染毒后2小时、7天、14天、21天各亚组大鼠鼠尾静脉取血5 ml进行MBP和MPO血清浓度测定。

1.5 标本制作各亚组大鼠在相应时间点，使用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射将大鼠深度麻醉迅速进行心脏灌洗固定后取脑行HE染色。

1.6 统计学方法采用SPSS 23.0统计软件分析数据。计量资料以均数±标准差表示，重复测量数据比较采用方差分析及LSD-t检验；穿越平台次数用非参数秩和检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 动物中毒改变行为学大鼠腹腔注射CO后出现轻度活跃，烦躁，呼吸急促，部分大鼠出现明显躁狂、角弓反张。再次追加CO时大鼠表现为四肢瘫软、口唇黏膜发绀及肢体末端出现明显樱桃红色，甚至出现昏迷及死亡(图1，图2)。整个染毒过程，CO组大鼠死亡11只，雌激素组死亡4只，空气组大鼠全部存活，死亡大鼠及时用备用大鼠补充。CO组大鼠16小时内检测其COHb浓度为(54.09±3.67)%，而空气组COHb浓度为(0.65±0.28)%。

图1 大鼠CO中毒后出现昏迷

图2 大鼠CO中毒后口唇粘膜出现樱桃红色

2.2 水迷宫试验结果在水迷宫试验中，CO组大鼠逃避潜伏期在第3～21天均大于空气组(P<0.05)；CO组与雌激素组大鼠分别在14天和7天相比逃避潜伏期明显延迟(P<0.05)，空气组在各时间点逃避潜伏期无明显延迟(P> 0.05)，见表1。在空间探索实验中，CO组较空气组及雌激素组在第14天时穿过平台次数明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 HE染色结果空气组大鼠在各时间点海马CA1区细胞排列整齐，细胞结构完整；CO中毒组海马组织神经元肿胀，细胞核出现固缩、破碎，染色质碎裂，胞质和胞核界限不清；雌激素处理组在各时间点神经元细胞坏死和CO中毒组相比一定程度上减轻。见图1。

表1 三组大鼠各时间点逃避潜伏期比较 (s)

a与空气组比较，P<0.05；b与雌激素组比较，P<0.05；c与造模前及3d、7d比较，P<0.05

图1 各组海马组织在14天HE染色(×400倍) a：空气组海马CA1正常细胞；b：CO组海马CA1细胞坏死明显；c：雌激素海马CA1细胞。

2.4 酶联免疫法空气组大鼠血清MBP、MPO浓度无明显差异，差异无统计学意义(P> 0.05)。CO组MBP水平明显高于空气组和雌激素组(P<0.05)(表2)。CO组在第14天MPO浓度水平较空气组及雌激素组也明显增加(表3)。

表2 三组大鼠各时间点MBP水平 (μg/L)

a与空气组及雌激素组比较，P<0.05

表3 三组大鼠各时间点MPO水平 (μg/L)

a与空气组及雌激素组比较，p<0.05

3 讨论

目前DEACMP的发病机制尚不明确，很多临床及动物实验发现其发病与炎症反应、免疫损伤、氧化应激、细胞凋亡、脑白质脱髓鞘等可能存在关系[5，6]。既往研究证实海马发挥着认知、学习、记忆等重要功能，其损伤和多种疾病的发生密切相关[7]。我们的实验结果显示，CO中毒后大鼠海马组织出现了严重的病理损伤，主要表现为出现大量变性和坏死的神经元，在中毒第14天时达到高峰。Morris水迷宫主要检测大鼠的空间记忆能力，主要涉及海马相关脑区，在本实验水迷宫实验中结果中大鼠在CO中毒后的14～21天，逃避潜伏期出现明显延迟，空间探索中经过目标象限的次数也明显减少，说明大鼠在第14～21天发生了迟发型脑病导致的记忆认知功能损伤。因此我们通过水迷宫实验和海马组织学分析筛选出在急性CO中毒后出现了迟发型脑病的大鼠用于实验研究是有效的。

美国学者在研究中发现CO中毒后，脑内自由基生成增加可引起脂质过氧化，导致脑内MBP的改变[8]。MBP作为髓鞘中抗原活性最强的蛋白质，位于髓鞘浆膜面，能够维持髓鞘结构和功能的稳定[9]。当中枢神经系统遭受损伤时，髓鞘受到破坏，血脑屏障及通透性改变，可造成MBP在血清中浓度增高[10]。研究表明，MBP在脑损伤、脱髓鞘疾病、缺血性脑血管病、神经退行性疾病及慢性神经性疼痛疾病中广泛存在，可作为神经系统相关性损伤标志物[11，12]。本文实验结果可以看出，急性CO中毒后血清MBP明显增加，说明在CO中毒后大鼠存在脱髓鞘改变，发生了MBP的降解，导致血清MBP浓度的增加，进一步证明MBP可能参与了急性CO中毒后迟发性脑病的发病过程。而MPO作为一种独立于其他炎症因子的一种新的炎症因子，与人类多种疾病的发生、发展密切相关，是炎症和氧化应激的标志物[13]。MPO能通过氧化作用产生的自由基，造成与神经元损伤，因其水平与中性粒细胞的活化密切相关，可作为中性粒细胞功能和活化的标志[14]。本研究表明急性CO中毒后可能出现逐渐加重的炎症反应，MPO增高可能激活中性粒细胞并引发炎性反应，限制红细胞中的氧转运，导致组织缺氧，进一步出现迟发型脑病。

近年来很多实验发现雌激素在脑外伤、卒中、神经变性疾病中发挥重要的保护作用[15]。其能透过血脑屏障，聚集在脑组织的不同部位，如皮质及海马区、下丘脑等，与细胞内受体结合，通过抑制细胞凋亡、抗氧化应激、抗炎、加速病理性蛋白的清除起到神经保护以及提高认知的目的[16]。人体雌激素有三种类型，17-β雌二醇(17-βestradio，17-βE2)、雌酮(Estrone)和代谢产物雌三醇(estriol)，其中17-β雌二醇生物效能最强。因此在我们实验中选择17-βE2治疗CO中毒大鼠，并评估其疗效。实验结果显示与CO中毒组相比，雌激素治疗组大鼠在中毒后7天和14天的逃避潜伏期明显缩短，在空间探索实验中，在第21天时穿过平台次数明显增多。在HE染色结果中，雌激素治疗组在各时间点海马组织水肿和神经元细胞坏死减轻，正常神经元细胞数目增多。而在对血清MBP、MPO测定结果中显示，雌激素治疗组各时间点MBP水平明显于低于CO组。与CO中毒组相比，雌激素组MPO水平在第14天也明显减少。说明大鼠发生急性CO中毒后，出现脱髓鞘改变、免疫炎症反应等，而雌激素雌激素可通过多种途径改善代谢，减轻氧化应激诱导的免疫炎症反应损伤，有效保护神经细胞和组织。

本实验中，CO中毒后，MBP及MPO的表达均明显增加，而在使用雌激素治疗后MBP及MPO的表达减少。雌激素可能通过抑制CO中毒大鼠后MBP、MPO的表达，阻断中性粒细胞的活化和炎症反应介导的神经损伤，减少细胞坏死，减轻脱髓鞘损伤，维持髓鞘结构和功能的稳定，一定程度上阻断了迟发型脑病的发生，从而起到保护作用。但目前其具体发病机制尚不明确，还需进一步实验研究。