ALDH2 rs671基因多态性与非酒精性脂肪性肝病相关性研究*

李颖怡，郭翠芬，章瑞南，汪保灿，潘 勤，汪余勤，曹海霞，范建高

随着不合理的膳食结构和不健康的生活方式的流行，非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的发病率在全球逐年上升[1，2]。在我国，NAFLD占慢性肝病的49.3%[3]，是遗传因素与环境因素共同作用的一组代谢性肝病，其发病机制尚未阐明[2，4]。愈来愈多的研究揭示了基因多态性与NAFLD发病的关系，patatin样磷脂酶域3（PNPLA3）、跨膜蛋白6超家族成员2（TM6SF2）、溶血脂酰肌醇酰基转移酶1（MBOAT7）和葡萄糖激酶调节蛋白（GCKR）等多个基因被认为参与了NAFLD发生和发展，尤其在部分非肥胖的NAFLD患者，基因多态性可能发挥着重要的作用[5，6]。乙醛脱氢酶2（acetaldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）是酒精代谢的关键作用酶，ALDH2 rs671突变在我国人群高发，可造成人体对乙醛的代谢能力下降，导致饮酒者“喝酒脸红”现象。近年来有研究表明，ALDH2 rs671多态性与酒精性肝病和代谢综合征密切相关[7，8]。本研究旨在探讨ALDH2 rs671多态性与NAFLD发病的相关性，希望能发现我国NAFLD患者新的遗传危险因素，有助于早期识别易感人群。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2017年3月～2018年3月于上海交通大学医学院附属新华医院消化科住院的患者，排除有过量饮酒史（男性＞140 g/w、女性＞70 g/w）、病毒性肝炎、药物性肝损伤、胆源性肝损伤、自身免疫性肝病、遗传代谢性肝病、全胃肠外营养、重度营养不良（BMI＜16 kg/m2）和合并严重的心肝肾功能不全者。该研究通过新华医院医学伦理委员会审查，在获得调查对象知情同意后开展研究。

1.2 一般资料和血生化检测 采集性别、年龄、身高、体质量、腰围、臀围等信息，并计算体质指数（body mass index，BMI）=体质量（kg）/身高 2（m2）、腰臀比=腰围/臀围、腰高比=腰围/身高。所有患者入院第2天晨起空腹抽取静脉血，使用日本Hitachi公司 7600型全自动生化分析仪检测血生化指标，计算脂肪肝指数（fatty liver index，FLI）和胰岛素抵抗指数（insulin resistance index，HOMA-IR）。

1.3 ALDH2 rs671测序和分型 采集外周静脉血3 ml，提取基因组DNA，行PCR扩增，使用美国 ABI测序仪测序。ALDH2 rs671位点上游引物为5'-CAAATTACAGGGTCAACTGCTAT-3'，下游引物为5'-CAGCAGGTCCTGAACTTCCA-3'，由生工生物工程股份有限公司设计合成并完成单核苷酸多态性（SNP）测序和分型。

1.4 肝脏脂肪沉积和弹性检测 使用Fibroscan 502（法国 Echosens公司）检测受控衰减参数（controlled attenuation parameter，CAP）和肝硬度 测 量（liver stiffness measurement，LSM）。CAP 值≥238 dB/m 提示脂肪肝，CAP值＜238 dB/m则归入无脂肪肝组。

1.5 统计学分析 应用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验或Mann-Whitney U检验，计数资料比较采用卡方检验，检验水准为P＜0.05。采用Pearson x2检验进行遗传平衡检验。采用非条件Logistic回归控制混杂因素，计算比值比（odd ratio，OR）及其95%可信区间 （confidence interval，CI），表示基因多态性与NAFLD患病的相对风险度。

2 结果

2.1 基线资料 纳入研究对象120例，男性50例，女性70例；年龄12～80岁，平均年龄为（55.38±12.64）岁。根据CAP检测结果发现脂肪肝73例，无脂肪肝人群47例，两组间性别和年龄分布无显著性差异（P＞005）。脂肪肝组合并肥胖、高血压病和血糖异常的比例明显高于无脂肪肝组（67.1% 对 23.4%，64.4% 对42.6%和27.4% 对 8.5%）；脂肪肝组体质量、BMI、腰围、臀围、腰臀比、腰高比、空腹血糖和甘油三酯水平均显著高于无脂肪肝组（P＜0.05），脂肪肝组血清ALT、AST、GGT水平均显著高于无脂肪肝组（P＜0.05）。

2.2 ALDH2 rs671基因分型和遗传平衡检验情况ALDH2 rs671位点基因型产物均为288 bp片段（图1）。经测序检测发现ALDH2 rs671单核苷酸多态性为GG、GA和AA 3种基因型，其中GG为野生型，GA为突变杂合型，而AA为突变型（即ALDH2*1/1、ALDH2*1/2和ALDH2*2/2，图2）。GG、GA和AA基因型分布频率分别为55.0%、38.3%和6.7%，经吻合度检验，各组基因多态性分布均符合Hardy-Weinberg（H-W）遗传平衡法则（P=0.997），说明样本来自同一群体（图3）。

图1 PCR扩增 显示ALDH2 rs671位点基因型产物为288 bp片段

2.3 ALDH2 rs671多态性与脂肪肝患病风险的相关性分析 应用显性模型和等位基因模型分析发现脂肪肝组GA/AA型占比（52.1%）显著高于无脂肪肝组（34.0%），等位基因A占比（29.5%）显著高于无脂肪肝组（20.2%）。根据性别和BMI行亚组分析，在女性和超重人群（BMI≥23 kg/m2）中，脂肪肝组GA/AA型占比显著高于无脂肪肝组（分别为48.8%对22.2%和53.3% 对23.1%，P＜0.05）；经非条件Logistic回归分析发现，GA/AA型脂肪肝患病风险是GG型的3.756倍，校正年龄、性别、BMI、腰围、空腹血糖、甘油三酯和高血压后仍具有统计学意义（OR=3.756，95CI%=1.208～11.672，P=0.022）。

2.4 不同ALDH2 rs671基因型者人体学和生化指标的差异分析 GA/AA型者体质量、BMI、腰围、臀围、腰臀比、腰高比均显著高于GG型者，其中GG型体质量为（66.07±10.39） kg，而 GA/AA型者为（70.87±14.24）kg，两组间具有显著性差异（P=0.028）；GG 型者臀围为（95.35±6.95）cm，GA/AA 型者为（98.04±7.25）cm，两组间具有显著性差异（P=0.043）；GA/AA型者腰高比超标（≥0.6）的比例显著大于GG型者（28.8% 对13.6%，P=0.042）。分别取ALT、AST、GGT 后四分位，将 ALT、AST、GGT 水平超过后四分位者定义为肝酶升高，结果发现GA/AA型者肝酶升高者比例更高，GGT水平显著高于GG型者【（55.57±99.97） U/L 对（38.17±48.02） U/L，P=0.047】；他们的CAP值和脂肪肝指数均显著高于GG 型者【（265.61±56.37） dB/m 对（246.38±60.81）dB/m，P=0.078和（4.15±8.58 对 2.04±3.77，P=0.071），而两组LSM值无显著性差异【（4.96±1.49）kPa对（6.22±7.51） kPa，P=0.706】；GA/AA 型者空腹血糖、空腹胰岛素、糖化血红蛋白、HOMA-IR、甘油三酯、总胆固醇、非高密度脂蛋白胆固醇和血尿酸水平均与GG型者无显著性差异（P＞0.05）。

图2 ALDH2 rs671测序图

图3 ALDH2 rs671基因型和等位基因频率与遗传平衡检验

3 讨论

ALDH2是体内乙醛及其他醛类物质的关键代谢酶[9-11]，参与醛类的清除、能量代谢、脂质代谢、氧化应激和细胞凋亡等多种重要的病理生理过程[12-14]。ALDH2基因位于12号染色体上[15]，其主要突变位点ALDH2 rs671在我国高达39%～57%[14]，该突变改变了ALDH2酶的氢键稳定性，使其催化活性明显降低，对乙醛的水解能力降低[16]。近年来，国内外已有多项研究表明ALDH2 rs671多态性与冠心病、高血压病、糖尿病和肿瘤的发生具有相关性[14]。但ALDH2 rs671多态性与NAFLD的研究报道目前尚少。

研究酒精代谢在NASH疾病进展中的作用时发现，ADH和ALDH的表达和功能均出现显著改变[17]。在该研究的两个NASH组中均可见4-羟基壬烯醛蛋白加合物的显著积累和ALDH2蛋白表达的明显增加，提示ALDH2在对抗NASH氧化应激中发挥作用。使用ALDH2激动剂Alda-1干预apoE-/-小鼠，可以观察到动脉粥样硬化程度及肝脏脂肪变程度的改善，提示激活ALDH2可以改善NAFLD[18]。相反，抑制ALDH2能够增强乙醛介导的肝细胞固醇调节元件结合蛋白-1通路（sterol regulatory elementbinding protein，SREBP-1）的活性，增加肝脏甘油三酯的沉积[19]。日本Oniki et al[20]在一项队列研究中，在对341例不饮酒或少量饮酒的研究对象进行4～6年的随访后发现，突变基因ALDH2*2携带者中NAFLD发病率较非携带者高，并且，GGT水平升高（≥25.5 IU/L）的ALDH2*2基因携带者的NAFLD患病风险显著升高。在本研究中，脂肪肝组的GA/AA型比例显著高于无脂肪肝组，经Logistic回归分析发现，GA/AA型者脂肪肝患病风险显著增加，提示GA/AA型可能是NAFLD的潜在危险因素，并且，对女性和超重患者影响更大。

GGT是过量酒精摄入和肝损伤的标志，也反映了氧化应激程度。GGT水平的升高与肝细胞损伤以及肝脏脂肪沉积程度密切相关。本研究发现，GA/AA型者GGT水平显著高于GG型者，提示GA/AA型较GG型人群更容易出现肝细胞损伤和更严重的脂肪变。此外，本研究发现GA/AA型者CAP值和脂肪肝指数均高于GG型，同时，GA/AA型者ALT、AST、GGT升高的比例也均高于 GG型。携带ALDH2*2基因的喝酒脸红的中国人除了需警惕酒精性肝病的发生外，还需要警惕脂肪肝以及NASH的发生。

ALDH2还与脂质代谢、脂肪的形成和分布密切相关。研究发现PKC-ALDH2通路在脂肪细胞的分化中起了重要作用，PKC-ALDH2通路的激活可以增强脂肪细胞分化、加速成脂，并减弱4-羟基壬烯醛介导的PPARγ通路对脂肪生成的异常调节。我国和东亚的全基因组关联研究显示ALDH2 rs671是肥胖的易感基因位点，其多态性与BMI的增加和内脏脂肪的沉积具有显著相关性。本研究数据显示GA/AA型各项人体学指标，如体质量、BMI、腰围、臀围、腰臀比、腰高比等，均高于GG型，提示ALDH2 rs671基因多态性与肥胖可能具有潜在的相关性。