叶面喷施含Bacillus amyloliquefaciens SQR9复合微生物液体肥料的肥效研究①

卢云峰，许 航，段华泰，梅新兰，李 荣，管晓进，张 楠，沈其荣

叶面喷施含SQR9复合微生物液体肥料的肥效研究①

卢云峰1，许 航1，段华泰1，梅新兰1，李 荣1*，管晓进2*，张 楠1，沈其荣1

(1 江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室/江苏省有机固体废弃物资源化协同创新中心/国家有机肥类肥料工程技术研究中心/南京农业大学资源与环境科学学院，南京 210095；2 生态环境部南京环境科学研究所，南京 210042)

研究叶面喷施含SQR9复合微生物液体肥料在辣椒和白菜上的应用效果，以期开发出根际有益微生物新的应用模式和新的叶面肥产品。以辣椒和白菜为供试材料，设以下6个处理评估肥料效果：喷施清水处理(CK)、喷施与复合微生物液体肥料等养分的化肥处理(CF)、喷施含化肥+氨基酸+糖蜜的水溶肥处理(T1)、喷施含化肥+氨基酸+糖蜜+微量元素的水溶肥处理(T2)、喷施含化肥+氨基酸+糖蜜+SQR9的水溶肥处理(T3)和喷施含化肥+氨基酸+糖蜜+微量元素+SQR9的复合微生物液体肥料处理(T4)。盆栽试验结果表明，与其他5个处理(CK、CF、T1、T2、T3)相比，T4处理在各项促生指标上虽未全部达到显著性差异，但其更能够促进辣椒和白菜的生长，提高其生物学性状。可培养微生物数量上，新型含菌株SQR9复合微生物液体肥料的喷施，增加了叶际芽孢杆菌的数量；与喷施清水对照(CK)和与复合微生物液体肥料等养分的化肥处理(CF)相比，其他4个处理(T1、T2、T3、T4)对辣椒和白菜叶际可培养微生物数量影响更大，而喷施含SQR9复合微生物液体肥料(T4)的影响更为明显。叶面喷施含SQR9复合微生物液体肥料可有效促进辣椒和白菜的生长。

解淀粉芽孢杆菌SQR9；微量元素；叶面喷施；玉米；白菜；复合微生物液体肥料

复合微生物肥料是指由两种或两种以上互不拮抗的有效微生物或有特殊功能的单一微生物(固氮、溶磷、解钾类微生物)与一些营养物质加工复合而成的微生物制品，其应用于农业生产后，能获得特定的肥料效应，其制品中的活性微生物为发挥作用的关键，分为液体剂型和固体剂型[1-3]。复合营养物质的复合微生物肥料因其具有改良土壤、增加作物产量和改善品质、提高植株的抗逆性和抗病虫害能力、对微生态环境起保护作用等特点[4-7]，其研究和应用越来越受到人们的关注和认可。因含有一定量的养分，复合微生物肥料液体剂型中的功能菌在肥料中易于死亡，数量和活性下降，影响了肥料的效果，也因此得到科研、生产等各界的广泛关注。近年来，对复合微生物液体肥料的应用研究主要是集中在根部灌施方面[8-11]，在叶面喷施方面的研究还比较少，而叶面喷施养分全面、针对性强、肥料用量少、肥料利用率高、肥效快[12-13]，因此，对复合微生物液体肥料叶面喷施方面的研究同样具有重要意义。

植物根际益生菌(plant growth-promoting rhizo­bacteria，PGPR) 是一类能够在植物根际有效定殖，不仅对植物生长和增收有直接或间接促进作用，还能对植物病害有一定防控作用的一类有益微生物的统称[14]。传统根际有益微生物的应用模式主要为根际灌施或制成生物有机肥施入土壤[15]。近年来，随着研究的不断深入和市场的需求，植物根际促生菌的概念和研究范围，已从根际扩大至叶围的研究领域[16]。解淀粉芽孢杆菌() SQR9是本实验室从黄瓜根际分离筛选获得、并鉴定保存的一株适应能力较强的革兰氏阳性菌，它能够在植物的根际有效定殖促进植物生长和防控土传病害[17]。将菌株SQR9接入到秸秆、动物粪便等一些有机物料中进行腐熟堆肥制成的生物有机肥已经被广泛地应用于农业生产中，且在促进作物生长、增收和防控土传病害等方面取得了显著的效果[18-20]。但迄今为止，仍然还未有叶面喷施该功能菌株的研究。

本研究在以上背景下，选择SQR9为目标菌株，以酸解废弃猪毛所制成的氨基酸为主要原料，鳌合一定量的微量元素，配比一定量的养分和糖蜜研制成含SQR9复合微生物液体肥料，并通过在辣椒和白菜叶面喷施，研究该新型水溶肥料的促生效果，以期开发出根际有益微生物新的应用模式和新的叶面肥产品。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试微生物 供试功能微生物为本实验室分离保存的具有防控土传病害和促进植物生长的根际促生解淀粉芽孢杆菌SQR9(SQR9)[18]，该菌株为革兰氏阳性菌，寄存于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.5808。

1.1.2 供试培养基 蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，去离子水1 000 ml，pH 6.5 ~ 7.0；完全溶解后分装到三角瓶，115 ℃灭菌 30 min。

1.1.3 供试氨基酸 氨基酸水解液由本实验室研制，主要通过酸解废弃猪毛制得，总氮(N)含量28.4 g/kg，全磷(P2O5)含量0.76 g/kg。

1.1.4 供试作物 辣椒(超大甜椒王)和白菜(精纯改良青杂三号)种子均购自江苏省农业科学院。

1.1.5 供试肥料 腐熟鸡粪有机肥由南通惠农生物有机肥有限公司提供，含水量20%，有机质≥45%、全氮1.31%、全磷(P2O5)2.64%、全钾(K2O)1.55%。供试化肥：氮肥为尿素(含N 46.4%)，磷钾肥为磷酸氢二钾(含K2O 54.0%、含P2O517.8%)。

1.2 试验设计

1.2.1 复合微生物液体肥料的制备 ①将菌株SQR9接种到LB培养液中液体发酵生产，使发酵液中含菌或芽孢量≥1×109cfu/ml；②用200 ml氨基酸分别鳌合微量元素，微量元素含量分别为Fe 0.6%、Mn 0.5%、B 0.2%、Zn 0.5%、Cu 0.3% 和M 0.05%；③将尿素、磷酸氢二钾、糖蜜、鳌合了微量元素的氨基酸、去离子水混合搅拌均匀，用KOH调节pH至4.0 ~ 4.5。其中，尿素、磷酸氢二钾、糖蜜、氨基酸液和去离子水的量分别为100 g、50 g、200 ml、200 ml和400 ml；④往搅拌均匀、调节好pH的液体肥料中添加3% 的表面活性剂，并搅拌均匀；⑤将步骤①制备的菌株SQR9发酵液接种到步骤④制备的液体肥料中，接种量为10%，并定容至1 L，测得总养分为100 g/kg(包括液体氨基酸所含养分)，即得成品复合微生物液体肥料。

1.2.2 盆栽试验设计 盆栽试验于2017 年9—10月在江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室温室内进行，供试土壤采自江苏宜兴，基本性质如下：pH 7.24，有机质15.44 g/kg，全氮1.96 g/kg，全磷1.62 g/kg，全钾11.58 g/kg，有效磷21.26 mg/kg，速效钾86.53 mg/kg。供试作物为辣椒和白菜，共设6个处理：处理1(CK)：喷施清水；处理2(CF)：喷施与复合微生物液体肥料等养分的化肥；处理3(T1)：喷施含化肥+氨基酸+糖蜜的水溶肥；处理4(T2)：喷施含化肥+氨基酸+糖蜜+微量元素的水溶肥；处理5(T3)：喷施含化肥+氨基酸+糖蜜+SQR9的水溶肥；处理6(T4)：喷施含化肥+氨基酸+糖蜜+微量元素+ SQR9的复合微生物液体肥料。每个处理9个重复，每个盆钵装土3 kg ，添加1%(肥料干重/土干重)的腐熟鸡粪有机肥与土拌匀作为基肥，选取长势均一的种苗移栽。于移栽7 d后开始喷施肥料，6 d喷施一次，共喷施3次，均按500倍稀释喷施，喷施时间为晴天的早上、傍晚或者阴天进行。

1.3 测试项目及方法

1.3.1 生物学性状的测定 于移栽后35 d时测定各处理的株高、茎粗、叶绿素相对含量测量值(SPAD值)、叶长、叶宽、叶片数、地上部鲜质量和干质量、地下部鲜质量和干质量。株高、茎粗和SPAD 值分别选用钢卷尺、得威斯游标卡尺和TYS-A 型叶绿素测定仪进行测定；叶长、叶宽选用直尺进行测定；地上部鲜质量和干质量、地下部鲜质量和干质量用百分之一天平进行测定，将称完鲜重后的植株放置于牛皮纸袋中于105 °C下杀青15 min后，于70 °C下烘干至恒重，称重[21]。

1.3.2 辣椒和白菜叶际中芽孢杆菌、细菌和真菌数量的测定 芽孢杆菌采用半选择性培养基涂布测定[22-23]，培养基配方如下：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、琼脂2.5%、去离子水1 000 ml，pH 7.2 ~ 7.4，121 ℃高压灭菌20 min。1% 多粘菌素2 ml/L、1% 放线菌酮4 ml/L(抗生素在培养基倒前冷却后加入)。测定步骤如下[24]：各处理分别取相同叶位的新鲜叶片 5 g，无菌环境下剪碎放入装有 45 ml 无菌水的三角瓶内，匀浆2 min，再用超声波震荡2 min 混匀[25]。将样品稀释成不同梯度稀释液后，用无菌吸管各取0.1 ml涂布于相应培养基平板中，于30 ℃培养36 h 后计数。细菌培养采用牛肉膏蛋白胨固体培养基[24]，真菌采用马丁-孟加拉红培养基[26]，叶际中可培养细菌和真菌数量的测定操作步骤与芽孢杆菌相同。细菌和真菌分别于30 ℃和28 ℃培养36 h 和72 h 后计数。菌落统计结果均以cfu/g 鲜叶重表示。

1.4 数据分析

采用Excel 2010和SPSS 13.0软件进行数据统计分析，使用最小显著差异法(least significant diffe­rence，LSD) 检验进行多重比较(<0. 05)。

2 结果与分析

2.1 喷施不同肥料对辣椒生物学性状的影响

不同处理对辣椒生物学性状的影响如表1所示。在株高和茎粗方面，喷施复合微生物液体肥料处理(T4)优于其他处理，且具有显著性差异；T3与T1间无显著性差异，但指标均高于T1，表明功能菌的应用能够提高辣椒的株高和茎粗；T2与T1之间具有显著性差异，表明微量元素的添加也能够提高辣椒的株高和茎粗。在SPAD值方面，5个喷施肥料处理与CK之间均存在显著性差异，且喷施复合微生物液体肥料处理效果最优(T4>T3>T2>T1)。在叶片数方面，5个喷施肥料处理与CK之间均存在显著性差异，同时T4显著优于T1、CF和CK。在地上部鲜物质量和干物质量方面，T4处理显著优于其他处理，同时T3与T1、T2与T1间均具有显著性差异，表明功能菌和微量元素的应用能够提高辣椒地上部鲜物质量和干物质量，两者结合后效果更优。在地下部鲜物质量方面，CF、T1、T2、T3、T4处理间均没有显著性差异，但均与CK处理存在显著性差异；在地下部干物质量方面，T4显著优于T1、CF 和CK，且无论鲜物质量还是干物质量，T4处理均为最高，表明复合微生物肥料的施用同样能够促进地下部的生长。

表1 不同处理对辣椒生物学性状的影响

注：表中数据表示平均值±标准偏差。同列数据小写字母不同表示处理间差异达到<0.05显著水平，下表同。

2.2 喷施不同肥料对白菜生物学性状的影响

不同处理对白菜生物学性状的影响如表2所示。在株高、叶长和叶绿素SPAD值方面，T4处理与T2处理间无显著性差异，但均显著优于T3、T1、CF 和CK，表明微量元素的添加能够促进白菜的株高、叶长和叶绿素含量，其中T4处理要优于T2处理，表明功能菌同样起到了促生作用。在叶片数和叶宽方面，T4、T3、T2和T1之间均无显著性差异，但均显著优于CK，且T4>T3> T2> T1。在地上部鲜物质量和干物质量方面，T4>T3> T2> T1>CF>CK，且T4显著优于除T2外其他处理和对照，表明功能菌和微量元素的添加均起到了促生效果。在地下部鲜物质量方面，CF、T1、T2、T3和 T4处理间均没有显著性差异，但均与CK处理存在显著性差异。在地下部干物质量方面，T4、T3、T2、T1、CF、CK之间均无显著性差异，但T4、T2和T1显著优于CK。

表2 不同处理对白菜生物学性状的影响

2.3 不同处理对辣椒和白菜叶际中芽孢杆菌数量的影响

不同处理对辣椒叶际中芽孢杆菌数量的影响如图1A 所示，T3和 T4处理间无显著性差异，但显著高于 T1、T2、CF、CK 处理；T1与 T2和 CK 处理间均无显著性差异，但显著高于 CF 处理，且 T2、CF 和 CK 间无显著性差异。

2.4 不同处理对辣椒叶际中可培养微生物数量的影响

不同处理对辣椒叶际中可培养细菌数量的影响如图2A所示，T4和T3处理间无显著性差异，但显著高于其他处理；T1和T2处理均与CK存在显著性差异，但T1、T2和CF处理间无显著性差异；CF 和CK间无显著性差异。不同处理对辣椒叶际中可培养真菌数量的影响如图2B所示，CK与CF处理间无显著性差异，但高于其他处理；CF、T1、T2和T3处理间无显著性差异。

不同处理对白菜叶际中芽孢杆菌数量的影响如图1B所示，T3和 T4处理间无显著性差异，但显著高于T2、T1、CF和CK，且 T1、T2、CF、CK 处理间无显著性差异。

结果表明，含SQR9 复合微生物液体肥料能够提高辣椒和白菜叶际中芽孢杆菌的数量(T3和 T4处理)，且含化肥+氨基酸+糖蜜+微量元素+SQR9 的复合微生物液体肥料的效果最佳，推测SQR9 在辣椒和白菜叶际得到了有效定殖。

(图中小写字母不同表示处理间差异达到P<0.05显著水平，下图同)

(A：细菌数量，B：真菌数量)

2.5 不同处理对白菜叶际中可培养微生物数量的影响

不同处理对白菜叶际中可培养细菌数量的影响如图3A所示，T3和T4处理间无显著性差异，但显著高于T2、CF 和CK处理；T1、T2和CF处理间无显著性差异；T1显著高于CK。不同处理对白菜叶际中可培养真菌数量的影响如图3B所示，CK和CF高于T1、T2、T3和T4处理，且CK与各施有机肥处理间具有显著性差异。

(A：细菌数量，B：真菌数量)

3 讨论

辣椒和白菜的盆栽试验结果表明，综合各项指标，添加了功能菌的水溶肥料的效果均要优于未添加的，功能菌SQR9 促进植物生长的效果已经在多种作物上被证明[27-28]，本研究进一步表明叶面喷施 SQR9 菌株同样能够有效促进植物的生长，研究结果能够为根际有益菌应用范围的拓宽提供依据。添加了微量元素的水溶肥料同样体现出优异的促生作用，微量元素是作物体内很多化学反应中所必需酶或辅酶的重要组成部分，对植物的生长发育起着至关重要的作用[29]，刘广富等[30]的研究同样表明，在辣椒种植过程中添加微量元素肥料能够有效提高辣椒生物学性状、产量和品质。同时添加了氨基酸、微量元素和功能菌SQR9 的T4处理比其他处理(CF、T1、T2、T3)和对照(CK)更要优异，其更能够促进辣椒和白菜的生长，提高辣椒和白菜的生物学性状，推断是氨基酸、微量元素和功能菌株的协同作用，氨基酸同样已经被广泛证明能够有效促进植物的生长[31-32]，王蓓等[33]研究表明，在辣椒和豇豆叶面喷施氨基酸水溶肥料能有效提高它们的产量，本研究进一步证实了联合多种促生因子，能够进一步提高叶面水溶肥的促生效果，为高效叶面水溶肥的开发提供了依据。

对辣椒和白菜叶际中芽孢杆菌的数量测定结果表明，含SQR9水溶肥料(T3和 T4处理)喷施到辣椒和白菜叶部后，提高了辣椒和白菜叶际中芽孢杆菌的数量，推测增加的芽孢杆菌中含有试验添加的SQR9。谢兰芬等[34]研究表明，在玉米叶片上喷雾解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2 菌液后，能够在玉米叶片上检测到该菌株，说明解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2 能够在玉米叶际有效定殖。因此，根据叶际芽孢杆菌数量增加，表明功能菌在叶际的有效定殖是新型水溶肥叶际发挥作用的重要原因。

植物的叶、茎、花、果等地上有效部分组成的生境统称为叶际，生存在其表面和内部的大量的各种类型的微生物称为叶际微生物[35]，它们发挥着重要的生态功能，能改变宿主微环境、防御病害、促进生长、降解有害污染物和固氮[36-39]等。本研究在获得促生效应的同时，初步研究了叶面喷施含SQR9复合微生物液体肥料对辣椒和白菜叶际可培养微生物数量的影响。结果表明，喷施该肥料能显著提高辣椒和白菜叶际中细菌的数量，降低真菌的数量。有大量研究表明，细菌生物有机肥施用后能促进根际土壤中细菌和放线菌的增殖，降低真菌数量，进而改善微生物群落结构[21, 41-42]。因此，初步推测含SQR9复合微生物液体肥料的施用，同样能够改善叶际微生物群落结构，改善微生物环境。

综上，叶面喷施以解淀粉芽孢杆菌SQR9 为目标菌株，酸解废弃猪毛所制成的氨基酸为主要原料、并鳌合一定量的微量元素、配比一定量的养分和糖蜜研制成的复合微生物液体肥料可有效促进辣椒和白菜的生长，改变辣椒和白菜叶际微生物组成。

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Foliar Spraying of Liquid Compound Microbial FertilizerContainingSQR9 Promoted Plant Growth

LU Yunfeng1, XU Hang1, DUAN Huatai1, MEI Xinlan1, LI Rong1*, GUAN Xiaojin2*, ZHANG Nan1, SHEN Qirong1

(1 Jiangsu Key Laboratory of Solid Organic Waste Utilization/Jiangsu Collaborative Innovation Center for Solid Organic Waste Resource Utilization / National Engineering Research Center for Organic-based Fertilizer / College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2 Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Ecology and Environment, Nanjing 210042, China)

This research aims to study the effects of foliar spraying of compound microbial liquid fertilizer containingSQR9 on the plant growth for developing a novel application mode of plant growth-promoting rhizobacteria and a novel foliage liquid fertilizer. Pepper and cabbage were selected as the tested model crops, and pot experiments were performed containing 6 treatments: spraying with water (CK), water soluble chemical fertilizer (CF), water soluble fertilizer containing chemical fertilizer, amino acids, and molasses (T1), water soluble fertilizer containing chemical fertilizer, amino acids, molasses, and microelement (T2), water soluble fertilizer containing chemical fertilizer, amino acids, molasses, and strain SQR9(T3), liquid compound microbial fertilizer containing chemical fertilizer, amino acids, molasses, microelement, and strain SQR9(T4). Pot experiment results showed that compared to the other five treatments (CK, CF, T1, T2, T3), T4treatment efficiently promoted pepper and cabbage growth by improving their biological characters; and the results from the number of cultural microbes showed that compared to CK and CF, the other four treatments (T1, T2, T3, T4), after application of strain SQR9 containing fertilizers effectively enhanced the number ofand led to greater impact on the culturable microbial population in pepper and cabbage phyllosphere with the greatest influence for T4treatment. In conclusion, the liquid compound microbial fertilizer containingSQR9 can effectively promote the growth of pepper and cabbage by foliar spraying.

SQR9; Microelement; Foliar spraying; Pepper; Cabbage; Compound microbial liquid fertilizer

国家重点研发计划项目(2017YFD0200805、2016YFD0800605)、江苏高校品牌专业建设工程资助项目(PPZY2015A061)和校大学生创新训练项目(1713A24)资助。

lirong@njau.edu.cn; guanxiaojin@ofdc.org.cn)

卢云峰(1992—)，男，云南大理人，硕士研究生，主要从事土壤微生物与生物肥料研究。E-mail: 2284932093@qq.com

S144.1

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10.13758/j.cnki.tr.2019.05.009