角膜碱烧伤中PMNs与MMP-9的关系

宋东宇，高明宏，李冬梅

0引言

角膜碱烧伤是临床上常见的严重致盲性眼外伤，由于碱易于浸润至深层角膜，造成角膜病灶组织的溃疡溶解，烧伤早期即有复杂的炎症反应，多形核中性白细胞(polymorphonuclear neutrophils，PMNs)为病灶内重要的炎性细胞。PMNs浸润角膜基质层并不断吞噬坏死组织，直至引起PMNs细胞溶酶体破裂，产生大量蛋白酶加重基质层的溃疡溶解[1]。角膜基质层中含有大量的胶原成分，在碱烧伤溃疡损伤过程中有大量细胞因子、酶类参与，其中基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)在损伤中发挥了关键作用，MMP-9又称明胶酶B，活化后能分解多种胶原成分，易造成角膜基质层严重的溃疡溶解[2]。碱烧伤后的病理损伤机制非常复杂，角膜病灶区严重的炎症反应和基质层溃疡溶解并存，两者是否具有一致性，如何认识PMNs与MMP-9的相互作用及其关系，尚需深入研究。本文通过建立在体动物角膜碱烧伤模型，探究角膜碱烧伤后PMNs浸润和MMP-9的表达时相，并且创新性的研究二者的相关性，为深入研究及治疗角膜碱烧伤提供理论依据。

图1裂隙灯下观察角膜碱烧伤情况A：碱烧伤后3d,角膜基质层溃疡水肿，病灶边界不清；B：碱烧伤后14d,角膜基质层严重溃疡溶解；C：碱烧伤后28d，角膜基质层溃疡减轻，瘢痕形成。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物选用健康清洁级新西兰白兔25只(首都医科大学动物研究中心提供)，10～12月龄，体质量2.0～3.0kg，雌雄均用，右眼为实验眼，左眼为正常对照眼，实验前仔细检查眼部无病变。动物实验过程中，严格遵循国家科技部颁布的《实验动物管理条例》，同时本研究获得朝阳市中心医院伦理委员会的批准。

1.1.2实验器材使用试剂：鼠抗兔MMP-9抗体(Abcam)；辣根酶标记山羊抗鼠IgG、SP及DAB试剂盒(Bioss);纤维滤纸(BOSTER)。使用仪器：超净工作平台(SW-CJ-IFD，沈阳)、匀速振荡器(JHYC-3，苏州)、水浴箱(ZD600，苏州)、精密切片机(HM325，美国)、漂烘器(ZMN-6802，日本)、图像分析仪(Image8000，北京)、裂隙灯(SL-6F，苏州)、高倍显微镜(CK53，深圳)和图像分析系统(Image Plus6.0，沈阳)。

1.2方法

1.2.1角膜碱烧伤模型的建立依据中华医学会眼外伤学组制定的角膜烧伤标准，建立兔右眼角膜Ⅲ级碱烧伤的动物模型，操作由同一有经验的实验人员完成。为确保滤纸片大小形状一致，用直径为8.0mm的角膜移植环钻钻取多张圆形单层滤纸片，充分浸泡于1.0mol/L NaOH溶液中10s，镊子夹取后置于器皿盒内备用。器械固定实验兔头部，右眼置开睑器，20g/L盐酸丙美卡因滴眼液点眼4次充分表面麻醉，把浸泡备用的滤纸片置于角膜中央区，确保滤纸与角膜表面充分接触，计时1min后取下，注射器抽取大量生理盐水冲洗上睑穹窿部及角结膜表面5min，确保无NaOH溶液残留(经反复预实验，碱烧伤角膜1min,生理盐水冲洗5min，能确保角膜达到Ⅲ级烧伤，且烧伤程度不至于角膜穿孔)。按此方法对25只兔右眼均进行角膜碱烧伤模型的建立[2]。

1.2.2模型治疗及处理角膜碱烧伤后3d内，角膜损伤较重，为避免角膜穿孔和实验动物的眼部不适，兔双眼(实验组和对照组)均给予非抗生素药物，小牛血去蛋白提取物眼用凝胶，4次/d，点双眼。分别于碱烧伤后3、7、14、21和28d从模型兔中随机选取5只，按照0.2mL/100g体质量腹腔注射氯胺酮和氯丙嗪1∶1混合液麻醉后，裂隙灯下观察双眼角膜并进行眼表照相，随即静脉注入空气窒息法处死[2]。实验动物发生严重眼内出血或角膜溶解穿孔则予剔除。

1.2.3角膜处理和数据获取兔被麻醉处死后，沿角膜缘环形剪开球结膜及筋膜，快速剪断眼外肌和视神经，摘除双侧眼球，完整切取带有1.0mm宽巩膜的角膜组织，10%甲醛溶液固定24～48h，常规不同浓度乙醇梯度脱水，应用二甲苯溶液致透明化，石蜡包埋，4μm连续切片[1]。

2结果

2.1裂隙灯下观察碱烧伤后3d兔右眼球表面大量粘稠分泌物，烧伤病灶呈现边界不清的灰白色溃疡，深度达角膜基质层，窥视不清眼内结构(图1A)。14d实验组的角膜溃疡深度及面积最为严重，病灶周边大量新生血管生长，角膜病灶溃疡溶解最重，达高峰期(图1B)。28d实验组角膜溃疡区基本瘢痕化，表面新生血管生长，透明度极差(图1C)。对照组角膜无明显变化。

图2HE染色切片观察PMNs和新生血管(×400)A：碱烧伤后3d；B：碱烧伤后14d。三角示PMNs,箭头示新生血管。B图与A图比较，可见碱烧伤后PMNs和新生血管增多,角膜基质纤维更为紊乱。

图3MMP-9阳性表达(SABC×400)A：角膜碱烧伤后14d，大量MMP-9表达；B：角膜碱烧伤后28d，MMP-9表达趋于下降。

组别眼数MMP-9实验组内相互比较q值(P值)7d14d21d28d正常对照组250.0015±0.0006碱烧伤3d50.2842±0.01304.1534(<0.05)10.1663 (<0.01)4.7294(<0.05)2.4355(>0.05)碱烧伤7d50.2431±0.015014.3197 (<0.01)8.8829(<0.01)1.7180(>0.05)碱烧伤14d50.3848±0.03405.4368(<0.01)12.6017(<0.01)碱烧伤21d50.3310±0.02707.1649(<0.01)碱烧伤28d50.2601±0.0130

2.2 HE染色切片观察400倍生物显微镜下观察HE染色切片，PMNs为镜下视野内胞核蓝色且深染的细胞。碱烧伤后3d，角膜溃疡区上皮组织缺如，基质层水肿肥厚，胶原纤维部分紊乱，角膜上皮下及基质层可见少量PMNs；碱烧伤后14d，病灶区周边残存的上皮层细胞水肿，基质层溶解变薄，大量纤维溶解断裂且排列紊乱，可见新生血管生长，特别是溃疡溶解区的基质层细胞中存在大量PMNs浸润，呈团簇样存在且胞核较大(图2)。

2.3 PMNs的量值兔角膜碱烧伤后3、7、14、21、28d角膜病灶组织中PMNs密度值分别为58.34±4.67、46.34±2.36、90.07±5.67、83.23±3.31和43.28±3.45个/1000μm2。正常对照组角膜基质内几乎未见PMNs细胞。实验组不同时间点PMNs密度值变化比较明显，碱烧伤后3d角膜基质层即可见大量PMNs浸润，7d时数量略有下降，继而快速增多，即在14d时达到顶峰，之后逐渐减少，28d时下降至接近7d时数量。

2.4角膜碱烧伤后MMP-9的表达碱烧伤后的角膜基质层溶解高峰出现在14d，观察免疫组化图片可发现碱烧伤14d的角膜基质层中MMP-9的量值达到顶峰，随后角膜碱烧伤后的28d，MMP-9的表达明显减少，角膜溶解溃疡的病损修复过程与MMP-9的表达紧密相关(图3)。

经检验分析，实验数据服从正态分布，满足方差齐性，实验组内各时间点MMP-9阳性细胞平均光密度值随时间延长出现明显波动(先上升后下降)，差异有统计学意义(F=33.78，P<0.01)。兔左眼为对照组(正常眼)，各时间点MMP-9阳性细胞平均光密度值平稳无变化，求取平均值作为对照组均值。不同时间点实验组MMP-9阳性细胞平均光密度值均高于对照组，组间均数比较用Dunnett-t检验(表1)，3、7、14、21和28d差异明显，均具有统计学意义(P<0.05)。实验组内各时间点的MMP-9阳性细胞平均光密度值相互比较用SNK-q检验(表1)，可见不同时间点MMP-9阳性细胞平均光密度值变化明显(P<0.05)，碱烧伤后3d即有大量MMP-9产生，7d时有所下降，之后明显提升且在14d时达到高峰，14d后逐渐降低，在28d降至接近烧伤7d时水平。

2.5量值相关性角膜碱烧伤后病灶组织内PMNs的浸润与MMP-9的表达的量值呈正态分布，对两组数值进行Pearson相关性检验，呈正相关(r=0.963，P=0.004)。

3讨论

角膜碱烧伤是临床上较为多见的，治疗较为困难的严重眼表疾病，早期即出现大量炎性细胞浸润，随着病程的进展常可见眼表持续性病损、角膜溃疡溶解、角膜混浊瘢痕及大量新生血管等，尤其是角膜基质层损伤较重，细胞外基质(extracelluar matrix,ECM)主要包括胶原、蛋白多糖、糖蛋白、糖胺多糖和弹力纤维五大类，其中胶原是ECM中最丰富的结构成分。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)可作为降解细胞外基质的酶类，在角膜组织溃疡溶解损伤及细胞迁移修复中发挥重要的作用[3]，而MMP-9作为MMPs家族中的重要一员，在角膜基质的病理损伤过程中能够降解大量胶原[4-5]。MMP-9又被称为明胶酶B，相对分子量为92kD，以无活性的酶原形式分泌，主要存在于角膜基质层中，活化后能降解Ⅳ型胶原、Ⅴ型胶原、弹性蛋白和明胶。正常角膜中只能微量检测到MMP-9表达，而在兔角膜碱烧伤后的病灶区内，MMP-9表达明显增加，在我们的研究中，实验组与对照组的量值做统计学分析，均有统计学意义，可以说明MMP-9在角膜碱烧伤后的溃疡溶解中具有重要作用，并且与炎性反应明显呈正相关。在本研究中发现，免疫定位MMP-9，其主要分布于溃疡的角膜基质、浸润的炎细胞和新生血管的内皮细胞中，这与Ma等[6]通过原位酶谱技术检测的研究结果相一致，MMP-9能够大量降解角膜基质，从而引起严重的损伤。

研究发现碱烧伤后3d角膜上皮层及基质层病灶中就存在大量的PMNs浸润，第7d量值却有下降，碱烧伤后的14d则达到浸润的峰值，大量角膜基质溃疡溶解，甚至是穿孔，伤后14d为角膜组织病理损伤的严重期，炎症反应也最为严重，PMNs浸润达到最大值，角膜碱烧伤后的溃疡溶解与PMNs的浸润水平显著相关，这与报道文献[2,7]的研究一致。因正常对照组的角膜基质层未见明显的PMNs存在，实验组与对照组差异明显，我们未进行组间的统计学分析。在空间分布上，早期PMNs分布在碱烧伤创口边缘的角膜基质内，主要有外源性碱性物质致伤所引起，角膜表面无浸润；后期PMNs浸润部位与溃疡部位一致，主要是与免疫性炎症反应相关，这与Peebo等[8]的研究结果相同。碱烧伤后PMNs浸润损伤角膜组织的病程进展快速，进入角膜基质的PMNs大量吞噬坏死物质，进而使溶酶体破裂，溶酶体酶大量进入角膜烧伤溃疡区，对胶原进行溶解破坏，有研究证实明胶酶MMP-9与中性白细胞相关[9-11]。Noerager等[12]通过对外周血中的PMNs细胞分离提取后，在PMNs碎裂物及上清液中分离到MMP-9的存在。而我们的研究是通过制做角膜碱烧伤的动物模型，在活体动物的角膜炎性病灶组织中测得PMNs及MMP-9的量值，所得实验数据更准确、直观，并对碱烧伤不同时相的PMNs与MMP-9量值做Pearson相关性检验，相关系数r=0.963，P=0.004，从而创新性地证明了二者关系密切，且具有明显正相关性。实验方式不同，无论是通过外周血的细胞提取，还是通过直接的活体动物实验，其结果具有一致性，但我们的实验数据直接在角膜炎症病灶内测得，更能表达和证实二者的相关性，且通过统计学分析证实相关性明显具有统计学意义(P<0.01)。

按照McCulley的研究，化学性角膜烧伤可以分为以下四期：角膜烧伤期(烧伤当时)、损伤急性期(0～7d)，角膜修复早期(1～3wk)和角膜修复晚期(大于3wk)[2,13]，我们通过建立动物模型，研究碱烧伤急性期、修复早期和修复晚期的角膜溃疡区的组织病理损伤及病程进展中PMNs浸润和MMP-9表达的时相，依据统计学分析充分证实二者具有明显正相关性，该理论能够为临床治疗角膜碱烧伤提供新思路。临床上治疗早期角膜碱烧伤，控制炎症即是抑制PMNs的浸润和减少MMP-9的大量表达，依据二者的正相关性，抑制炎性反应，促进上皮的早期修复，可以减少角膜病灶的溃疡溶解，进而有效地减轻角膜病灶的病理性损伤。

依据本研究中PMNs及MMP-9的变化曲线，在角膜碱烧伤后3d内就要频点抗炎眼液，早期应用小牛血去蛋白提取物眼用凝胶类药物，稀释残存碱性物质，促进上皮层的修复，减少炎性细胞浸润，而7～21d是烧伤后的角膜溃疡溶解期，在抗炎治疗的同时要抑制基质蛋白酶类的溶解作用。碱烧伤14d后，即可应用促进上皮和基质修复的眼膏或眼液，进而达到促进修复减少瘢痕的最佳疗效[2,13]。在临床诊治上，炎症反应和MMPs的溃疡降解密切相关，角膜碱烧伤的病理损伤是多因素共同作用的结果，炎症反应与新生血管生长因子的相互关系，MMPs家族中其他的酶类因子是否与炎性反应相关，尚需实验研究。