牦牛Caspase-3 克隆、序列分析与组织表达研究

夏 忆，卢建远，何向东，陈 莹，字向东

(西南民族大学动物科学国家民委重点实验室，四川 成都 610041)

牦牛(Bos grunniens)是青藏高原及周边地区特有畜种，分布于海拔2 500 ～5 500 米高寒、低氧、干燥、辐射强的极端环境中，是青藏高原人们赖以生存的重要畜种[1-2]，我国拥有1 400 万余头牦牛，占世界总量95%以上.牦牛是季节性发情畜种，发情期为7 月至10 月中旬，妊娠期为250 ～260 天，通常两年一胎或三年两胎，高产者在整个生命周期中也仅能繁殖4 ～5头，繁殖率较低，制约着牦牛的良种繁育及高原畜牧业发展[3-5].

天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白水解酶，简称半胱天冬酶( Aspartate - specific cysteinyl proteinase，Caspase)，能特异性切割靶蛋白天冬氨酸残基后的肽键，活性位点均包含半胱氨酸残基[6].Caspase 家族按功能分为两类，一是起始子：Caspase -8、Caspase -9、Caspase-10 等，主要功能为识别L -E -X -D 序列或V-E-X-D 序列[7]，使Caspase 最初以无活性酶原的形式存活于细胞中，在受到凋亡诱导的信号刺激后被激活，与胞膜受体或细胞内的促凋亡相关因子结合，使起始分子聚集并相互切割，活化后的起始子再切割下游效应Caspase；另一类是效应Caspase，如Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7，主要作用是识别天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸(D-E -VD)序列，作为上游Caspase 的底物，活化后作用于胞内多种蛋白质或酶[7-8].Caspase 级联反应中，Caspase-3 处在蛋白级联反应最核心的位置，是最重要的凋亡执行者[9]. 一旦细胞接受凋亡刺激，上游不同Caspase 蛋白酶切割Caspase - 3 酶原，活化后的Caspase-3 与底物反应，能使百余种蛋白水解，造成细胞染色质浓缩和DNA 片段化[10-12]. 在基因敲除Caspase-3 的小鼠中发现，与凋亡有关的形态学变化如染色质凝集、线粒体肿胀、细胞皱缩等都明显延迟甚至缺乏[13-14].

目前Caspase-3 基因在牦牛上的研究未见报道，本研究通过克隆牦牛Caspase -3 基因CDS 序列，检测比较牦牛与黄牛生殖轴Caspase-3 基因的表达，为研究Caspase-3 对生活于高寒、低氧、强辐射等极端环境条件下的牦牛生殖调控中的功能奠定基础.

1 材料与方法

1.1 实验动物及样品采集

2017 年9 月，选取4 ～5 周岁、健康、生长状态良好的牦牛与黄牛各5 头，采集组织，洗净后保存于液氮中.

1.2 主要试剂

Trizol、RevertAidTMFirst Stand c DNA°Synthesis 试剂盒、DreamTaq Green PCR Master Mix(2 ×)、PowerUp TMSYBRTM Green Master Mix 均购自赛默飞世尔中国公司；PCR 八联管购自Bio-Rad 公司.

1.3 方法

1.3.1 总RNA 提取和模板制备

取牦牛、黄牛各组织，按Trizol 说明书进行RNA抽提，并以提取的RNA 为模板，合成cDNA 第一链.

1.3.2 引物设计与扩增

根据黄牛Caspase-3 基因(XM_010820245.3)序列，利用Primer Premier 5.0 软件设计PCR 特异性引物(表1)，以5 头牦牛卵巢cDNA 第一链为模板，扩增牦牛Caspase -3 基因. PCR 扩增体系25 μL：ddH2O 9.5 μL、上下游引物、cDNA 各1 μL，2 ×Taq PCR Master Mix 12.5 μL；反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共32 个循环；72 ℃延伸15 min，4 ℃保存.

1.3.3 牦牛Caspase-3 基因生物信息学分析

使用ORF 在线程序(https：/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找序列开放阅框[2]；BLAST(https：/ /blast.ncbi.nlm. nih. gov/Blast. cgi)进行序列比对；ProtParam(https：/ /web.expasy.org/protparam)进行氨基酸理化性质分析；ProtScal(http：/ /expasy.org/tools/protscale.html)进行蛋白质亲疏水性预测[15]；Signal P4.0(http：/ /www. cbs. dtu. dk/services/Signal P/)进行蛋白质信号肽预测；PredictProtein(https：/ /predictprotein.org/home) 和SWISSMODEL(https：/ /swissmodel. expasy.org)进行蛋白质结构预测等[16].

1.3.4 实时荧光定量检测

使用Primer Premier 5.0 设计Caspase -3 和内参基因GADPH (EU195062.1)特异性荧光定量引物(表1)，反应总体系为15 μL：ddH2O 5.5 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA1 μL、PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 7.5 μL；反应程序：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，共39 个循环，每个样品重复检测3 次，并设置阴性对照.

表1 牦牛Caspase-3 基因引物序列Table 1 Primers used for yak Caspase-3 gene

1.3.5 统计学方法

使用SPSS 软件，2-ΔΔCt法对数据进行处理，采用独立样本t-检验对同组织不同物种表达差异进行比较，采用单因素差异显著分析对同物种不同组织表达差异进行比较，结果以“平均值±标准差”表示，当P＜0.05 时，具有统计学意义.

2 结果与分析

2.1 总RNA 提取

将Trizol 法抽提的RNA 进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，并用仪器检测OD 值(图1)，结果显示：5S、18S和28S 的RNA 完整，且条带明亮单一无弥散现象；OD 值界于1.9 ～2.0 之间，说明成功提取未污染、完整的RNA，满足后续实验要求.

图1 总RNA 检测1，2，3：黄牛RNA；4，5，6：牦牛RNA

2.2 Caspase-3 序列分析

通过电泳检测扩增产物，得到产物长度与预期相同，为长度963 bp 的条带(图2).获得牦牛Caspase-3 基因开放阅读框834 bp，编码277 个氨基酸.其中，A=33.1%、T=26.9%、C=18.4%、G=21.6%；A+T=60.0%、C +G =40.0%，存在一定碱基偏好. 与黄牛相比，发现4 个碱基突变，第354 位C→T，第399 位T→C，皆为沉默突变；而第659 位C→T，造成氨基酸改变Ala→Val；第678 位T→A，造成氨基酸Asn→Lys，将序列提交至NCBI，得到登录号：MK291254.

2.3 Caspase-3 蛋白分析

牦牛Caspase-3 蛋白分子式为C2546H4260N834O1059S154，分子质量为68436.02，由Ala(33.1%)、Cys(18.5%)、Gly(21.6%)与Thr(26.8%)组成.理论等电点为5.14；不稳定指数为43.95，半衰期为4.4h，推测是酸性不稳定蛋白；根据ProtScal 预测分析发现，牦牛Caspase-3 蛋白在第111 位氨基酸处有最小值，为-2.7；在第118 位氨基酸处有最大值，为2.133，亲水残基数大于疏水残基数，且蛋白质平均亲水系数为0.783，推测为亲水蛋白；根据SignalP4.0 预测结果显示牦牛Caspase-3 蛋白C(0.109)峰值在53 位氨基酸上，Y(0.104)峰值在53 位氨基酸上，S(0.107)峰值在37 位氨基酸上，综合判断，蛋白不存在信号肽，为非分泌蛋白；根据TMPRED 预测结果显示，蛋白无跨膜区域.

Caspase-3 蛋白二级结构显示，该蛋白包括无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β -转角4 部分，分别占据蛋白结构的50.18%、29.24%、15.16%、5.42%(图3).SWISS-MODEL 预测结果显示，蛋白质三级结构与二级结构成分预测结果基本一致.蛋白结构域预测表明，牦牛Caspase -3 具有CASc 家族典型结构域，在39 ～277 位氨基酸有特异结合位点，是CASc 超家族成员(图4).

图2 Caspase-3 基因PCR 产物电泳图Fig.2 Electrophoresis of Caspase-3 PCR products

图3 牦牛Caspase-3 蛋白二级结构预测Fig.3 Prediction of secondary structure of yak Caspase-3 protein

图4 牦牛Caspase-3 氨基酸序列生物功能预测Fig.4 Prediction of yak Caspase-3 amino acid biological function

2.4 Caspase-3 同源性对比及系统进化树

使用DNAMAN 将牦牛Caspase -3 与黄牛(XM_010820245.3)、山羊(NM_001286089.1)、绵羊(XM_015104560. 1)、野猪(NM _214131. 1)、马(NM _001163961. 1)、人(NM _004346. 4)、小鼠(NM _001284409.1)、大 鼠(NM_012922. 2) 与 鸡(NM_204725.1)进行核苷酸及蛋白质同源性分析(表2).结果显示：克隆所得牦牛序列与黄牛核苷酸、氨基酸同源性最高，分别为99.52%、99.28%；其次是山羊和大鼠等核苷酸同源性为96.62 ～81.21%，蛋白质同源性为94.55 ～83.27%；最后是牦牛与鸡核苷酸、氨基酸同源性最低，分别为71.32%、70.16%.

表2 Caspase-3 核苷酸与氨基酸同源性分析Table 2 nucleotide and amino acid homology analysis of Caspase-3

使用Clustal X 与MEGA6 对牦牛Caspase -3 构建进化树(图5)，发现牦牛与黄牛遗传距离最近，与同源性比较结果一致. 可以看出，牦牛与黄牛首先聚为一小类，再与山羊和绵羊聚为一类，其次与野猪、马、人、小鼠和大鼠聚为一类，最后与鸡聚为一类，系统进化树分析结果与遗传距离分析结果一致.

图5 牦牛Caspase-3 系统发生树Fig.5 Phylogenetic tree of yak Caspase-3

2.5 组织表达谱分析

利用荧光定量PCR 研究Caspase -3 在牦牛、黄牛各组织中mRNA 表达水平(图6). 结果表明，Caspase-3 在牦牛与黄牛的下丘脑、垂体、卵巢、输卵管和子宫组织中广泛表达，但表达模式不同. 牦牛组织中，表达趋势为输卵管＞下丘脑＞子宫＞卵巢＞垂体，其中输卵管的表达量显著高于垂体表达量(P ＜0.05)；黄牛组织中，表达趋势为子宫＞输卵管＞卵巢＞垂体＞下丘脑，子宫表达量显著高下丘脑表达量(P ＜0.05)；同时牦牛Caspase -3 组织表达量均高于黄牛相应组织，其中下丘脑、输卵管Caspase -3 表达量极显著高于黄牛(P ＜0.01)，子宫Caspase -3 表达量显著高于黄牛(P ＜0.05).

图6 牦牛与黄牛Caspase-3 的组织相对表达Fig. 6 Relative expression ofCaspase-3 gene in yak and cattle

3 讨论

众所周知，细胞凋亡是基因控制的程序性死亡，Caspase-3 是哺乳类细胞凋亡的重要执行者，处于蛋白级联反应的关键位置，也是介导细胞凋亡、降解底物活性的最强蛋白水解酶，已成为细胞凋亡的早期生化指标[17-18].

本试验成功克隆牦牛Caspase -3 基因CDS 序列，全长834 bp，其中A=33.1%、T=26.9%、C =18.4%、G=21.6%，编码277 个氨基酸，存在碱基偏好.与黄牛比发生两个突变，第659 位C→T、678 位T→A，造成Ala→Val、Asn→Lys 氨基酸改变，第354 位C→T、399 位T→C 属沉默突变. Xu 等使用Affymetrix-MegAllele Targeted 基因型检测系统和分子倒置探针技术发现，中国女性Caspase-3 和Caspase-7 多态性可能在子宫内膜癌易感性中发挥作用，Caspase 基因的遗传多态性可能改变基因表达水平和功能从而影响机体繁殖能力[19]. 牦牛第659、678 位基因突变是否导致基因表达水平和蛋白质功能改变，从而制约牦牛繁殖率，有待进一步研究. 李军对猪Caspase -3 基因克隆，扩增得834 bp 开放阅读框，发现猪Caspase-3 基因编码277 个氨基酸，蛋白分子量约为32kDa，猪Caspase-3 基因与人和鼠的Caspase -3 序列同源性高，与本实验结果基本一致[20].蛋白质结构域预测发现牦牛Caspase-3 具蛋白水解切割位点，活性部位，底物结合位点和二聚体界面等，是典型CASc 家族成员[13-14].蛋白质分析为酸性不稳定亲水蛋白，无信号肽，无跨膜区，二、三级结构分析得α -螺旋占据较大比重[20].

生物体本身存在清除活性氧的体系，例如：谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、SOD 酶、抗坏血酸等，这一体系使生物体内活性氧保持在对机体无害的水平.但牦牛生活的高辐射、高海拔、低含氧环境会导致体内产生大量活性氧[21]. 组织表达谱分析表明，Caspase-3 在牦牛和黄牛各组织中广泛表达，其中牦牛输卵管表达量显著高于Caspase -3 基因在其余部位的表达(P ＜0.05).输卵管是胚胎早期发育的重要器官，早期胚胎对氧化应激损伤异常敏感[22].在小鼠胚胎早期培养中，2 -细胞期胚胎对活性氧最敏感，也最容易发生生长阻滞[23].高浓度活性氧不仅影响2 -细胞期胚胎的基因调控，还引起胚胎氧化损伤，导致胚胎内部稳态失衡、胚胎发育能力下降及细胞质破碎，使胚胎进一步发生凋亡.同时，高活性氧处理组囊胚凋亡指数高于对照组， 囊胚率低于对照组[1-2，23-24].推测环境引起牦牛体内活性氧增加，会造成组织氧化损伤及胚胎凋亡率上升，可能是输卵管Caspase-3 表达量高的原因.在黄牛Caspase -3 组织表达谱中，子宫表达量显著高于其余组织(P ＜0.05)，研究认为子宫通过分泌多种有利激素来维持个体内分泌平衡、防止内分泌紊乱，是全身免疫中重要的一环，子宫细胞保持高凋亡率能有效预防肿瘤的形成[25].将子宫内膜中Survivin 过表达、Caspase -3 表达下调，打破凋亡与增殖的动态平衡，使子宫的凋亡功能减退，发现Survivin 与Caspase -3 的表达量可能在子宫内膜癌的发生中起一定作用[26]. 大鼠经2.45 GHz 电磁辐射后，卵巢上皮细胞Caspase-3 表达显著增加(P ＜0.05)，卵巢组织总氧化剂状态、氧化应激指数水平增加、子宫组织充血. 提示电离辐射可能导致大鼠的卵巢、输卵管和子宫组织的病理生理学或形态学变化[27].与未经加压的视网膜神经细胞相比，加压处理后的视网膜神经细胞80%开始表达Caspase-3，且在细胞光学显微镜下观察圆形及漂浮细胞较多，细胞体瘦小，大部分细胞崩解死亡[28].

推测，高海拔、高寒、强辐射的极端生存环境引起牦牛生殖轴中Caspase-3 高表达，造成生殖细胞凋亡率增加、组织发生病变，可能对牦牛繁殖性能产生不利影响.

4 结论

本研究成功克隆牦牛Caspase -3 基因CDS 区，编码区全长834 bp，编码277 个氨基酸；Caspase -3在物种间较保守且符合动物进化进程；组织表达谱中发现Caspase-3 在牦牛各组织中的表达量均高于黄牛且下丘脑、输卵管Caspase-3 表达量极显著高于黄牛(P ＜0.01)，子宫Caspase -3 表达量显著高于黄牛(P ＜0.05)，推测Caspase-3 基因的高表达量与牦牛的低繁殖率这一特性有关.