黄芩苷对H6N6禽流感患鼠血液指标的影响

李卫鹏，姚红艳，杨雪贞，马卫红，钱 林，欧德渊,陈 希

(贵州大学动物科学学院,贵阳550025)

禽流感(avian influenza，AI)是由禽流感病毒引起多种动物感染的高度接触性传染病。2014年，我国首次发生H5N6亚型AIV感染人致死的案例[1]。研究表明H5N6亚型AIV可由H5N1和H6N6重组形成[2]，其中H6N6亚型AIV已经可以在小鼠体内进行有效复制且引发呼吸道炎症病变，表明其可以感染哺乳动物[3-4]，所以对H6N6亚型AIV的防控对公共卫生具有重要意义。近年来，中药抗病毒的研究逐渐受到人们的重视，黄芩苷是黄芩中主要的有效成分，具有抗菌、消炎抗病毒的作用[5]。黄芩苷的体外研究表明，黄芩苷达到一定浓度时，具有抑制流感病毒增殖的作用[6]。在黄芩苷的体内研究中，有研究表明黄芩苷可以减轻流感病毒引起的小鼠肺部损伤、延长小鼠存活时间，具有明显的抗流感病毒作用[7]。研究拟探究不同浓度黄芩苷对感染鸭源H6N6亚型AIV的小鼠的血液指标的影响，为黄芩苷防控低致病性禽流感提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 昆明系小白鼠108只雌雄各半(6-8周龄、体重22.17±2.24g)购于重庆腾鑫生物技术有限公司。

1.1.2 试验毒株 H6N6亚型禽流感病毒，来源于贵州省动物疫病研究室。

1.1.3 主要试剂及仪器 黄芩苷(山西玉宁生物科技有限公司，批号：YN-20180512)，磷酸奥司他韦(宜昌长江药业有限公司，批号：H20055532)，EDTAK2抗凝管(江苏康健医疗用品有限公司)，PE-6800VET三分类动物血细胞分析仪(深圳市普康电子有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将108只6～8周龄昆明系小鼠随机平均分为6组：阴性对照组、病毒阳性组、西药对照组、低剂量黄芩苷组、中剂量黄芩苷组、高剂量黄芩苷组(所有剂量均结合文献依照《中药药理实验方法》进行体表面积换算所得)[8-10]。各组小鼠在相同条件环境下隔离饲养，自由采食和饮水。并于攻毒3 d后开始治疗，分别于治疗后3、6和9 d(各组每次采取6只小鼠)采用颈静脉放血法处死，用EDTAK2抗凝管采集血样。

1.2.2 攻毒与治疗 攻毒：阴性对照组尾静脉注射灭菌生理盐水0.2 mL/只，其余各组均尾静脉注射H6N6禽流感病毒(108EID50)0.2 mL/只。

治疗：攻毒3 d后进行灌胃给药，低剂量黄芩苷组(0.014 mg/只/d)，中剂量黄芩苷治疗组(0.028 mg/只/d)，高剂量黄芩苷治疗组(0.056 mg/只/d)，西药治疗组(0.39 mg/只/d)，病毒阳性组、阴性对照组每天给予等体积灭菌生理盐水。

1.2.3 检测方法 用血凝抑制试验检测实验组攻毒效果；血液指标用PE-6800VET三分类动物血细胞分析仪测定108份小鼠血样的血液指标。

1.2.4 数据统计 试验所得的结果采用SPSS20.0软件进行方差分析，数据用平均数±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 临床症状 小鼠在攻毒3 d后，出现呼吸急促，食欲低下，精神萎靡，被毛粗乱、无光泽等症状，病理解剖发现肺脏出血(图1)；病理组织学检查发现黄芩苷治疗组小鼠肺脏出血症状减轻(图2-图6)。

2.2 血清检测 用血凝抑制试验对试验组小鼠的血样进行血凝效价检测，攻毒后3、6和9 d血凝效价均≥24，空白对照血凝效价均<24，表明攻毒成功。

2.3 血液常规指标变化

2.3.1 白细胞总数指标 由表1可知，治疗3、6和9 d时，病毒阳性组白细胞总数均极显著高于阴性对照组和西药对照组(P<0.01)；高剂量黄芩苷组白细胞总数均极显著低于病毒阳性组和低、中剂量黄芩苷组(P<0.01)，显著高于西药对照组(P<0.05)。

表1 各组小鼠白细胞总数指标(n=6)Tab 1 Total leukocyte number index of mice in each group (n=6)

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。下同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference(P<0.05);And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference(P<0.01);While with the same or no letter superscripts mean no significant difference(P>0.05).The same as below.

2.3.2 中性粒细胞指标 由表2可知，治疗3、6和9 d时，病毒阳性组中性粒细胞数目均极显著高于阴性对照组和所有治疗组(P<0.01)；高剂量黄芩苷组中性粒细胞数目均极显著或显著低于低、中剂量黄芩苷组(P<0.01或P<0.05)，治疗3 d时，与西药对照组差异不显著(P>0.05)；治疗3和6 d时，高剂量黄芩苷治疗组中性粒细胞百分比均极显著或显著低于低、中剂量黄芩苷组(P<0.01或P<0.05)，与西药对照组差异不显著(P>0.05)。

图1 H6N6亚型禽流感患鼠肺脏出血图Fig 1 Pulmonary hemorrhage map of H6N6 subtype avian influenza mice

图2 病毒阳性组第3天(A)、第6天(B)、第9天(C)患鼠肺脏组织切片(HE染色×400)Fig 2 Lung tissue sections of mice infected with virus-positive group on day 3 (A),day 6 (B) and day 9 (C)were stained with HE×400.

图3 低剂量黄芩苷治疗组第3天(A)、第6天(B)、第9天(C)患鼠肺脏组织切片(HE染色×400)Fig 3 Lung tissue sections of rats in low dose baicalin treatment group on day 3 (A),day 6 (B) and day 9 (C) were stained with HE×400.

图4 中剂量黄芩苷治疗组第3天(A)、第6天(B)、第9天(C)患鼠肺脏组织切片(HE染色×400)Fig 4 Lung tissue sections of rats in middle dose baicalin treatment group on day 3 (A),day 6 (B) and day 9 (C)were stained with HE×400.

图6 西药对照组第3天(A)、第6天(B)、第9天(C)患鼠肺脏组织切片(HE染色×400)Fig 6 Lung tissue sections of rats in western medicine control group on day 3 (A),day 6 (B), day 9 (C)were stained with HE×400.

表2 各组小鼠中性粒细胞指标(n=6)Tab 2 Neutrophil indices of mice in each group (n=6)

2.3.3 淋巴细胞指标 由表3可知，治疗3、6和9 d时，高剂量黄芩苷治疗组淋巴细胞数目和淋巴细胞百分比均极显著或显著高于病毒阳性组、低剂量黄芩苷治疗组和中剂量黄芩苷治疗组(P<0.01或P<0.05)，与西药对照组差异不显著(P>0.05)。

表3 各组小鼠淋巴细胞指标(n=6)Tab 3 Lymphocyte indices of mice in each group (n=6)

2.3.4 红细胞指标 由表4可知，在治疗3、6和9 d时病毒阳性组红细胞数目均极显著低于所有治疗组(P<0.01)，治疗3和9 d时黄芩苷治疗组与西药对照组、阴性对照组差异不显著(P>0.05)，治疗6 d时，高剂量黄芩苷组与阴性对照组差异不显著(P>0.05)；在治疗3、6和9 d时，所有黄芩苷治疗组血红蛋白浓度和平均红细胞血红蛋白含量均极显著高于病毒阳性组(P<0.01)，与阴性对照组合西药对照组差异不显著(P>0.05)。

表4 各组小鼠红细胞指标(n=6)Tab 4 Erythrocyte indices of mice in each group (n=6)

2.3.5 血小板指标 由表5可知，在治疗3、6和9 d时病毒阳性组血小板数目均极显著高于阴性对照组和所有治疗组(P<0.01)，在治疗3 d时，所有黄芩苷治疗组与阴性对照组均差异不显著(P>0.05)，在治疗6和9 d时，低剂量、高剂量黄芩苷组与阴性对照组、西药对照组均差异不显著(P>0.05)，所有治疗时段中，各组血小板压积均差异不显著(P>0.05)。

表5 各组小鼠血小板指标(n=6)Tab 5 Platelet indices of mice in each group (n=6)

3 讨论与结论

3.1 黄芩苷可抑制H6N6亚型AIV感染小鼠的白细胞总数升高 在禽流感引起的病毒性炎症中，白细胞参与炎症的不同阶段。在H6N6亚型AIV入侵动物机体时，机体会产生免疫应答反应，产生炎症，其显微变化主要表现为肺炎、支气管炎等[11]。白细胞在炎症发生时，通过渗出、趋化性和吞噬作用等方式对机体进行保护。在赵维波[12]等人研究中，静脉注射禽流感病毒3 d后，小鼠白细胞总数、粒细胞数目均显著高于正常值。本试验小鼠感染H6N6亚型AIV后，治疗第3、6和9 d时病毒阳性组白细胞总数、中性粒细胞数目均极显著高于阴性对照组的结果也印证了这一点，根据血凝抑制试验结果和血液指标检测，表明造模成功。

在中药抗病毒的过程中，有直接作用和间接作用[13]。孙鹂[14]等研究发现，白细胞需要细胞黏附因子的参与，才能够通过微血管壁进入炎区。解晓霞[15]等的研究表明，黄芩苷能够抑制CD54、CD106、TNF-α、可溶性CD54的表达，从而抑制血管内皮细胞黏附因子的表达，降低炎性反应。黄芩苷可以通过抑制黏附因子的表达，从而降低白细胞渗出的数量，减少白细胞的聚集，从而可以减少白细胞所释放的酶类、炎症介质等引起或者加剧组织损伤。万巧凤[16]等的研究结果表明，黄芩苷可以通过抑制流感病毒感染的转录因子AP-1的高表达，从而降低炎性细胞的分泌，从而缓解炎症的病理损伤。本试验中黄芩苷治疗可有效抑制可抑制H6N6亚型AIV感染小鼠的白细胞总数升高，推测可能是黄芩苷通过抑制炎性因子的产生从而使减少白细胞的产生。

3.2 黄芩苷可降低禽流感患鼠的中性粒细胞数目

中性粒细胞在机体防御和抵抗病原侵袭过程中起着非常重要的作用，常见于急性炎症初期[17]。在禽流感病毒进入靶细胞的过程中，HA2亚基起到介导病毒遗传物质释放到细胞中的作用[18]。中性粒细胞需要通过趋化、黏附和吞噬等方式实现对机体的保护，此时不仅大量出现在炎区，外周循环血液中的数量也会增多[19]。

在本试验中，黄芩苷治疗组中性粒细胞数目均极显著低于病毒阳性组。杨洁[20]等人研究发现，黄芩苷可以通过抑制血凝素HA2亚基的活性，降低病毒遗传在细胞中的复制，从而抑制流感细胞对机体的侵入，这可能也是中性粒细胞数目降低的原因。

3.3 黄芩苷可升高禽流感患鼠的淋巴细胞数目 淋巴细胞常见于慢性炎症、炎症恢复期、病毒性炎症过程中，具有与抗原发生特异性反应的能力，其中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群在动物外周血中的分布量以及CD4+/CD8+的比值是重要的免疫状态检测指标[21]。誉铁欧[22]等通过对人感染H7N9禽流感流行病学研究发现，流感病毒攻击机体后淋巴细胞数目降低，T淋巴亚群降低等免疫失衡的现象。本试验治疗3、6和9 d时，病毒阳性组淋巴细胞数目均极显著低于阴性对照组这一结果也印证了这一点。薛洋[23]等研究发现，黄芩苷可以使传染性支气管炎患鸡鸡外周血内CD3+、CD8+T淋巴细胞显著增加，这与本试验黄芩苷治疗组淋巴细胞均极显著高于病毒阳性组的结果一致。

3.4 黄芩苷可以减少炎症中出血反应 在流感病毒侵袭动物机体的过程中，红细胞和血红蛋白的减少，常见于机体失血性贫血[24]，血小板数目的升高，预示着有炎症损伤或内脏器官出血或淤血[25]。在止血的过程中，血小板与纤维蛋白原的关系既是促进，又是抑制。在凝血环节PF2促进纤维蛋白原转变为纤维蛋白单体，加速凝血，减少红细胞从血管渗出，到了血栓后期，随着血小板解体和释放反应增加，释放纤溶酶原激活物，直接参与纤维蛋白溶解[26]。黄芩苷有强的抑制血小板聚集的作用，并能抑制纤维蛋白原转化为纤维蛋白，因而有抗凝血作用，通过减少血小板的聚集从而减轻炎症中组织器官淤血情况。本试验中治疗6d和9d时，中、高剂量黄芩苷组红细胞数目较病毒阳性组均极显著上升，所有治疗时段黄芩苷治疗组较病毒阳性组血小板总数均显著降低这一结果也印证了这一点。

3.5 结论 试验通过检测不同浓度黄芩苷治疗感染H6N6亚型禽流感病毒患鼠的血常规指标，与阴性对照组、病毒对照组、西药治疗组的血液指标进行对比，表明黄芩苷在较高浓度时对H6N6禽流感引起的炎症反应中，具有降低白细胞总数，抑制出血反应的作用。但由于黄芩苷水溶性差的特点，对于黄芩苷抗病毒的最适浓度，还需有待进一步的研究，以便对其更好的开发与利用。