大鲵抗菌肽家族基因对弗氏柠檬酸杆菌侵染的表达调控

王 慧，白 禹，杨文佳，李国勇，骆建林，曹 禹，李 灿

(贵阳学院贵州省大鲵可持续利用协同创新中心，贵州省山地珍稀动物与经济昆虫重点实验室，贵州 贵阳 550005)

【研究意义】近年来，大鲵(Andriasdavidianus)细菌性病害频发，特别是弗氏柠檬酸杆菌引起的败血症[1]。抗菌肽分布于大鲵多个组织器官，在免疫系统中发挥重要的作用，研究抗菌肽家族基因在病原菌侵染大鲵时的表达响应，对揭示分子层面的互作机制和控制疾病具有重要意义[2-4]。【前人研究进展】大鲵属于有尾目(Caudata)隐鳃鲵科(Cryptobranchidae)大鲵属(Andrias)，是目前现存两栖动物中个体最大，最珍贵的物种，被国家认定为二级野生保护动物。1978年，大鲵首次人工繁殖成功后，其人工养殖规模逐渐加大，贵州是大鲵人工养殖和繁育的主要地区之一，但大鲵在生长发育过程中受细菌、病毒和寄生虫的危害，导致多种疾病发生，特别是弗氏柠檬酸杆菌，导致幼鲵发病，患病大鲵出现不良或拒食等症状，后期出现头部、腹部肿大，皮下出血，最终死亡，会造成严重的经济损失。抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMPs)是机体免疫防御外界微生物入侵的重要屏障，具有广谱抗菌、强碱性等一系列特点。抗菌肽与细菌侵染的作用机制是抗菌肽直接作用于细菌的膜上，并形成跨膜的离子通道，造成细菌细胞内容物泄露，从而导致细菌死亡，达到防御细菌侵染，发挥机体免疫的作用[5-6]。【本研究切入点】目前，研究抗菌肽与细菌互作机制主要集中在蛙类、鱼类等，大鲵抗菌肽与细菌的作用机制研究较少，特别是研究抗菌肽基因在细菌侵染后的表达响应及调控更少。【拟解决的关键问题】2017年12月至2018年7月笔者在贵阳学院生命科学与资源环境学院，从大鲵不同组织部位对抗菌肽家族基因响应弗氏柠檬酸杆菌侵染入手，在不同时间检测基因的表达量变化，揭示大鲵抗菌肽与细菌的互作机制提供理论依据，为养殖实践中大鲵的免疫防御提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 弗氏柠檬酸杆菌与大鲵幼苗 弗氏柠檬酸杆菌，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。大鲵幼苗，购自贵州省翔盛大鲵繁养有限责任公司。

1.1.2 主要试剂 RNA提取试剂盒，购自北京全式金试剂有限公司；cDNA反转录试剂盒，购自TAKARA公司；SYBR Green PCR Master Mix试剂盒，购自北京全式金试剂有限公司。

1.1.3 仪器 BIO-RAD Gel DOCTM型凝胶成像仪，雪科IMS-130全自动雪花制冰机，Thermo 900 series超低温冰箱，BIO-GEN MIlli-Qirect 16 超纯水仪，博讯SW-CJ-1FD垂直超净工作台，RAY LEIGH UV18-01分光光度计。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的配制 将弗氏柠檬酸杆菌接种于LB平板上，37 ℃培养24 h后接种于LB液体培养基中，37 ℃摇床培养24 h，使用紫外分光光度计检测OD600=0.6，浓度为1×108CFU/mL。

1.2.2 大鲵病原菌接种试验 供试大鲵250～300 g，分为4组，每组15尾，暂养1周后无任何病变可用于接种试验。第1组为对照组，接种1×PBS 0.5 mL/尾，第2组接种弗氏柠檬酸杆菌0.5 mL/尾。接种后0、12、24、36、48 h，分别从对照组和试验组中各取3尾大鲵，无菌解剖后取皮肤、肝脏和脾脏组织速冻于液氮中备用[7]。

1.2.3 RNA提取与cDNA的合成 冻存组织采用Trizol抽提总RNA，步骤参照Trizol试剂盒说明书。提取后用1 %琼脂糖凝胶电泳电泳25 min，检测总RNA质量；用核酸蛋白仪(Eppendorf)检测总RNA的浓度，OD260/OD280值在1.8～2.0为合格样品。反转录使用反转录试剂盒RT reagent Kit (perfect Real Time，Takara)进行。反转录过程中向样品总RNA中加入1 μl DNA-Eraser后置于PCR仪中42 ℃、2 min。随后，加入反转录复合物和引物进行混合，混合终体积为10 μl，样品混匀后在PCR仪37 ℃、15 min，85 ℃、5 s进行反转录。cDNA反转后储存在-20 ℃冰箱，保存待用。

1.2.4 RT-PCR qRT-PCR采用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒，在Bio-rad CXF96荧光定量PCR仪上进行反应，步骤参照说明书，引物序列见表1。反应体系20 μl：SYBR Green PCR Mix 10 μl，上下游引物各1 μl(浓度为10 μmol/L)，cDNA模板1 μl，ddH2O 7 μl。反应条件：95 ℃预变性 2 min；95 ℃变性 15 s；55 ℃退火延伸15 s，共40个循环；65 ℃采集荧光信号。每个样品重复3次[8]。

1.3 统计分析

不同时间点相关基因的表达量采用2-△△Ct法，基因的相对表达量=处理样品(目的基因CT值-actinCT值)-0 h样品(目的基因CT值-actinCT值)。用SPSS 17.0统计软件中单因素方差分析对数据进行统计学分析，P<0.05表示差异显著；用软件SigmaPlot 12.5制图。

2 结果与分析

表1 qRT- PCR的检测基因和内参基因引物序列

Table 1 qPCR primer sequences of tested genes and internal reference genes

基因名称 Gene name引物序列(5′-3′) Primer sequenceAdCath 1F:TCAGTTCAGCCCAGGAAACTR:GGCACACGGTCTCTTTGATTAdCath 5F:CATGGCATCGGTTATTGACAR:CGCACTCTTCAGGGTTTCTCAdCath 8F:ACTCTGGCACAGGAGGAAGAR:GAGGCAGTGCGTGATAGTGARPL13F:CCATGGTGGCTAAGCAAGTTR:TGTGAGGCAGCATACCTCTGEF1-αF:GGACAGACCCGTGAACATGCR:CTTCCTTAGTGATCTCCTCGTAGC

注：AdCath1，AdCath5，AdCath8为课题组前期分析大鲵转录组数据，对比后获得的抗菌肽家族基因。

Note:AdCath1,AdCath5, andAdCath8are the research group's pre-analytic data ofA.davidianustranscriptome, and the antibacterial peptide family genes are obtained after comparison.

图1 大鲵总RNA电泳检测图谱

2.1 RNA质量

对大鲵皮肤，肝脏和脾脏抽提的RNA质量进行检测，清晰可见RNA的2条主带28SrRNA和18SrRNA(图1)，表明提取的总RNA分子完整性好，可以用于下一步试验。

2.2 大鲵皮肤组织抗菌肽家族基因对弗氏柠檬酸杆菌的响应表达

从图2看出，在大鲵皮肤组织中抗菌肽基因AdCath1、AdCath5、AdCath8在不同时间点均有表达，其中，AdCath1表达量在12～48 h相较于0 h表达上调，且与对照组(1×PBS)相比，弗氏柠檬酸杆菌处理上调显著，在36 h时AdCath1表达量是对照的92.35倍。AdCath5 在24～48 h弗氏柠檬酸杆菌处理的表达显著高于对照，但12 h时显著低于对照，表明AdCath5 对弗氏柠檬酸杆菌处理积极响应调控，24 h时响应更明显。AdCath8在不同时间点均积极响应表达调控，在36 h时弗氏柠檬酸杆菌处理的表达量显著高于对照18.58倍。

2.3 大鲵肝脏组织抗菌肽家族基因对弗氏柠檬酸杆菌的响应表达

从图3看出，在大鲵肝脏组织中抗菌肽基因AdCath1、AdCath5、AdCath8在不同时间点均有表达，其中，AdCath1表达量在12～48 h相较于0 h表达上调，与对照相比，弗氏柠檬酸杆菌处理的上调显著，且随着时间延长表达量逐渐升高，在48 h时表达量是对照的52.99倍。AdCath5在24～48 h弗氏柠檬酸杆菌处理的表达显著高于对照组，在24 h时表达量是对照的5.53倍，表明AdCath5对弗氏柠檬酸杆菌积极响应调控。AdCath8在不同时间点积极响应表达调控，随着时间延长表达量上调更明显，在48 h弗氏柠檬酸杆菌处理的表达量是对照的7.38倍。

2.4 大鲵脾脏组织抗菌肽家族基因对弗氏柠檬酸杆菌的响应表达

从图4看出，在大鲵脾脏组织中抗菌肽基因AdCath1、AdCath5、AdCath8在不同时间点均有表达，其中AdCath1和AdCath8在12～48 h相较于0 h表达量上调，与对照组相比，弗氏柠檬酸杆菌处理的上调显著，在24 h时表达量上调最明显，分别是对照组的5.70和8.06倍。AdCath5在48 h时表达量最高，弗氏柠檬酸杆菌处理的表达量是对照组的2.61倍，24 h时是对照组的8.00倍。

图2 大鲵抗菌肽基因AdCath 1、AdCath 5和AdCath 8不同时间点皮肤相对表达量

图3 大鲵抗菌肽基因AdCath 1、AdCath 5和AdCath 8不同时间点肝脏相对表达量

图4 大鲵抗菌肽基因AdCath 1、AdCath 5和AdCath 8不同时间点脾脏相对表达量

3 讨 论

抗菌肽具有广谱的抗菌性，且活性较高，如一种抗菌肽可抑制和杀死多种致病病菌，包括革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)[9-10]。因此，从抗菌肽的分子水平入手，通过转录组测序获得大鲵抗菌肽家族3个基因(AdCath1、AdCath5、AdCath8)的全长，研究其与病原菌互作过程中发挥的作用。柠檬酸杆菌是一种革兰氏阴性菌(G-)，可侵染大鲵，诱发病害及死亡，对大鲵资源保护及驯养繁殖造成严重的危害，研究柠檬酸杆菌与抗菌肽互作的分子机制迫在眉睫。

qRT-PCR方法广泛应用于分子生物学领域，且具有检测快速、高灵敏度检出等特点。通过qRT-PCR方法分析弗氏柠檬酸杆菌侵染不同时间点大鲵3个抗菌肽家族基因的响应，使用荧光嵌合法，对抗菌肽基因的表达量进行准确监测，检测方法简单快速，且国内外多篇文献均使用此方法进行基因表达分析[11]。结果表明，抗菌肽家族基因AdCath1、AdCath5、AdCath8在弗氏柠檬酸杆菌诱导后，不同时间点表达量均呈现上调趋势，且均高于1×PBS处理后的表达量，表明抗菌肽家族3个基因积极响应弗氏柠檬酸杆菌的侵染，对病原菌的侵染作出积极的调控。

大鲵人工养殖业发展已有几十年，但是涉及病害的研究较少，目前大鲵病害的研究主要集中在虹彩病毒引发的溃烂和出血等[12]，细菌病研究较少，特别是分子水平的研究。因此，从抗菌肽家族基因的分子机制出发，研究在细菌与寄主(大鲵)互作中抗菌肽基因的调控。目前，抗菌肽功能的研发已经成为科学研究的热点之一，如新药的开发，在转基因动物中的应用，在饲料中添加抗菌肽作为抑菌剂等。此研究可进一步弥补大鲵抗菌肽研究的空白，为病原菌和大鲵的互作机制提供理论依据。

4 结 论

抗菌肽家族基因AdCath1、AdCath5、AdCath8在弗氏柠檬酸杆菌侵染大鲵的不同时间点均发挥着积极的调控作用，呈现表达上调的普遍趋势，表明抗菌肽家族基因在病害侵染中起着积极的免疫作用。研究结果为大鲵抗病研究机制中抗菌肽的开发和应用奠定了理论基础。