棉籽糖对杂交鲟生长性能及非特异性免疫的影响

文/周云 邢薇 付海利 罗琳

北京市鲟鱼、鲑鳟鱼创新团队专栏

鲟鱼，又称鲟龙，是一种具有较高经济价值和营养价值的原始软骨硬鳞鱼类。由于其养殖模式的扩大、密度的增加及人工配合饲料营养不均衡等，造成鲟鱼养殖环境持续恶化，鱼体健康状况降低等一系列问题出现，有可能会在养殖过程中爆发大规模的疾病，进而给养殖户带来较大的经济损失。因此，在目前的养殖条件下，如何提高鲟鱼自身的免疫力从而减少鱼体对养殖环境的应激，避免鱼类疾病的爆发，是目前迫切需要解决的问题之一。

棉籽糖作为功能性低聚糖的重要组成部分，可以改善肠道菌群以及提高机体的免疫力，对动物体具有提高机体免疫力等多种生理功能。欧美及日本等国家对棉籽糖的研究较多，我国在这方面的研究报道相对较少，尤其是关于棉籽糖在鱼类的应用研究更是稀缺。因此，本实验拟通过在饲料中添加棉籽糖，研究其对杂交鲟生长性能及非特异性免疫功能的影响，为鲟鱼工厂化健康养殖以及棉籽糖在水产饲料中的应用提供一些参考。

一、材料与方法

（一）实验饲料

本实验所用饲料如下所示。

对照组：以鱼粉为主要蛋白源的基础饲料。

棉籽糖组：在基础饲料中添加棉籽糖。棉籽糖的纯度为90%，由北京中唐瑞德生物科技有限公司提供，所用剂量为推荐用量。棉籽糖用50℃的温水溶解后按照0.1%的添加量与基础料搅拌均匀，阴干，-20℃保存备用。

两组饲料均根据鱼体大小制成2.0mm和3.0mm两种不同粒径沉性饲料。饲料的基本组成见表1。

（二）实验鱼及饲养管理

实验用杂交鲟鱼由北京中科天利水产科技有限公司提供，实验鱼放入有循环流水养殖玻璃缸中（容积为260L）养殖。选取健康无伤的杂交鲟幼鱼240尾随机分为两组，每组设置4个重复，每个重复放入30尾鱼，平均体重为（37.5±0.0）g。实验开始前用基础饲料对杂交鲟进行2周驯养。实验开始后，每日饱食饲喂杂交鲟3次（9:00、13:00、17:00），根据杂交鲟的摄食情况适当调整投料量。实验持续8周，整个实验期间，维持养殖水温（16.5±1.0）℃，溶氧浓度为7.8mg/L。在此过程中如有死鱼，前两周内可以更换同样大小的鱼，两周后记录死亡鱼数和死亡鱼重量。

表1 实验饲料的基本组成成分和营养成分分析

（三）测定指标及方法

1.生长性能指标测定

实验结束后，记录每缸鱼的数量及总重，用于测定存活率、相对增重率、饲料系数、特定生长率及摄食率等指标。

存活率（SR，%）=（试验结束尾数/试验开始尾数）×100

相对增重率（WGR，%）=（最终体重-初始体重）/初始体重×100

饲料系数（FCR）=总投喂量/（最终体重-初始体重）

特定生长率（SGR，%/d）=100×（ln最终平均体重-ln初始平均体重）/实验天数

摄食率（FI，%）=100×摄食饲料干重/[实验天数×（初始体重+最终体重）/2]

2.血清非特异免疫指标测定

实验结束禁食24h后，分别从每个养殖缸中随机取3尾鱼，用2mL无菌注射器自尾静脉抽取血液置于2mL无菌离心管中，取100μL 全血置于装有1.5% EDTA-2Na溶液的抗凝管中，用于NBT的测定，将剩余血液1500rpm，4℃离心10min，然后取上清至无菌的1.5mL离心管中，暂放于-80℃冰箱保存，用于非特异性免疫指标的测定。

（1）呼吸爆发（NBT）

全血呼吸爆发活性的测定方法参照Sahoo的硝基四氮唑蓝（NBT）方法进行。在取得的100μL抗凝新鲜血液中加入100μL 0.2% NBT（nitroblue tetrazolium，sigma），37℃下孵育30min，取15μL 反应液，加入300μL N，N-二甲基甲酰胺（DMF），充分混匀，在2000rpm，4℃条件下离心5min，取上清200μL，于540nm下读取吸光值。

（2）溶菌酶活力（LZM）

采用透光度比色法测定溶菌酶活力。在一定浓度的混浊菌液中，由于溶菌酶能水解细菌细胞壁上肽聚糖从而使细胞裂解致使浓度降低，透光度增强，在530nm处根据透光度的变化计算溶菌酶的含量。

（3）丙二醛（MDA）

采用比色法测定丙二醛活性，过氧化脂质降解产物中的丙二醛（MDA）可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色降解产物，在532nm处为最大吸收峰换算成浓度。

（4）髓过氧化物酶（MPO）

采用比色法测定髓过氧化物酶活性，利用供氢体邻连茴香胺供氢后生成黄色化合物，在460nm处通过比色测定此产物的生成量，计算MPO活力及H2O2减少的量。

（5）超氧化酶歧化酶（SOD）

采用比色法测定超氧化物歧化酶活性，利用邻苯三酚在弱碱性环境中引发的自氧化反应，然后生成超氧阴离子自由基（O2-·），并在其自氧化过程中产生有色中间产物，在450nm处比色测定此产物的生成量，推算出SOD的活力。

（6）补体C3、C4

采用免疫比浊法测定补体C3、C4，样本中的补体C3、C4与其相应的抗体在液相中结合，然后形成抗原-抗体复合物，该反应会形成一定的浊度，在波长340nm条件下利用全自动生化分析仪测定补体C3、C4浓度。

（四）饲料成分分析

水分含量测定采用105℃烘干至恒重法（GB/T 6435-2006），粗蛋白质含量采用凯氏定氮法（GB/T 6432-2006），粗脂肪含量测定采用索氏抽提法，以石油醚作为抽提液（GB/T 6433-2006），粗灰分含量采用马弗炉（550℃）失重法测定（GB/T 6438-2006），总能量采用燃烧法测定（IKA，C6000，Germany）。

（五）数据分析

使用STATISTIC7.0统计软件对数据进行统计分析，利用单因素方差分析（one-way ANOVA），显著差异（P<0.05）时则采用Duncan’s法进行组间的多重比较。结果以平均值标准误（mean±SE）表示。

二、结果

（一）杂交鲟的生长性能

从表2中可以看出，棉籽糖组与对照组杂交鲟的存活率都是100%，但棉籽糖组鱼体的末均重、特定生长率、相对增重率及摄食率都显著高于对照组（P<0.05），而两组的饲料系数没有显著差异（P>0.05）。

（二）杂交鲟的非特异免疫指标

从表3中可以看出，棉籽糖组血清MPO和全血NBT活力显著高于对照组（P<0.05），但C3、C4、LZM、MDA及SOD活力与对照组之间无显著差异（P>0.05）。

三、讨论

（一）饲料中棉籽糖的添加对杂交鲟生长性能的影响

有研究指出，功能性低聚糖具有调节动物肠道微生态平衡，促进肠道中有益菌的增加，抑制肠道病原菌繁殖的作用，能提高动物体对营养物质的消化和吸收的能力，从而促进其生长性能。由本实验结果可知，饲料中添加棉籽糖后能够显著增加杂交鲟的增重率和特定生长率。此结果与饲料中添加棉籽糖对花鲈和草鱼的生长具有促进作用的结果相一致。Yan等的研究结果表明，饲料中添加1200mg/kg棉籽糖饲喂草鱼70天后能显著提高鱼体的特定生长率。葛红云等研究结果指出饲喂添加棉籽糖的饲料112天后，能显着增加花鲈的增重率。Mette等研究表明，与对照组相比饲料中添加棉籽糖后大西洋鲑鱼的特定生长率有显著提高的趋势。综合上述实验结果，说明添加棉籽糖具有促进杂交鲟鱼体生长的作用。

表2 棉籽糖对杂交鲟生长性能的影响

表3 棉籽糖对杂交鲟非特异性免疫指标影响

（二）饲料中棉籽糖的添加对杂交鲟非特异性免疫的影响

鱼类属于较低等的变温脊椎动物，由于其特异性免疫应答能力相对低下，故而非特异性免疫在免疫防御中具有重要的意义。

呼吸爆发是通过具有吞噬功能的细胞利用活性氧杀伤分子，将侵入机体的病原菌吞噬后使膜内结合的NAD（P）H氧化酶可以将分子氧转化为超氧阴离子（O2-·）的过程。呼吸爆发活性不仅与鱼类非特异性免疫能力正相关，它还是衡量吞噬细胞杀菌能力的一个直观指标。本实验中，投喂棉籽糖后，杂交鲟呼吸爆发活性显著高于对照组。说明饲料中添加棉籽糖后，能够显著增加杂交鲟鱼体的吞噬细胞对入侵病原的吞噬作用，从而提升细胞的免疫能力。

补体系统是机体非特异性免疫的重要组成部分。补体是由多种具有酶活性的球蛋白组成，具有增强体液和细胞介导的特异性免疫。补体C3在补体系统各成分中含量最多，对于鱼类是一种重要的防御机制，在溶菌杀菌、免疫调节以及免疫复合物溶解等方面具有生物学功效。补体C4是一种多功能β1-球蛋白，能够在补体活化、促进细胞吞噬功能、防止免疫复合物沉着以及中和病毒等方面发挥一定的作用。在本研究中，棉籽糖的添加对杂交鲟血清中C3、C4含量均无显著影响。Maqsood等研究，饲料中添加葡聚糖对鲤鱼血清中C3、C4含量无显著影响；姜娜等研究也表明壳聚糖的添加对血鹦鹉鱼血清中C3、C4含量均无显著影响，与本实验的结果一致。而周显青等研究发现维生素C只有在一定剂量范围内才能促进补体C3和C4合成，低于此范围对补体的产生无影响，高于此范围则产生抑制作用，且此剂量范围在不同动物间存在一定差异。因此本实验中补体C3和补体C4的研究结果可能就与棉籽糖的添加量有关，但其相关的机理尚需要进一步的研究和验证。

丙二醛是自由基氧化的终产物，不仅能够反映机体内脂质的过氧化程度，还会间接反映出机体组织细胞的氧化损伤程度，因此，测定鱼体丙二醛活性能够较准确的反应出其机体的自由基代谢状况以及机体组织的损伤情况，故而，测定丙二醛活性对于判断鱼体的健康状况具有较为重要的意义。作为动物机体中重要的抗氧化酶，超氧化物歧化酶对机体氧化与抗氧化平衡功能起着极为重要的作用，它能有效地清除超氧阴离子自由基，进而使自由基的形成与消除处于一种动态平衡状态，从而消除自由基对生物分子的损伤。本试验中，棉籽糖组血清丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性与对照组均无显著差异，说明棉籽糖对杂交鲟机体的抗氧化能力没有产生作用。

溶菌酶广泛存在于生物体液、血清和巨噬细胞中，它是机体受到外界刺激时的一种基本防御机制，在动物免疫防御中发挥着极为重要的作用。本实验结果显示，饲喂棉籽糖后杂交鲟血清中溶菌酶活性与对照组没有显著差异。王庆奎等对点带石斑鱼的研究发现，饲喂当归多糖7d后能显著提高鱼体血浆溶菌酶活性，但随着投喂当归多糖时间的增加，到21d、28d时，实验组与对照组相比均无显著差异。因此，本实验中饲喂棉籽糖8周后，溶菌酶活性与对照组相比没有差异的原因有可能是因为长期投喂棉籽糖后，机体中巨噬细胞、粒细胞等免疫细胞分泌溶菌酶的能力已经趋于平稳，因而投喂实验结束后棉籽糖组鱼体中的血清溶菌酶活性与对照组相比未有显著性差异。

髓过氧化物酶是一种血红素蛋白，它存在于中性粒细胞和单核细胞中，能够与H2O2反应后生成次氯酸，具有很强的杀菌作用。吞噬细胞还能够通过髓过氧化物酶杀灭和清除病原体，因而对增强机体免疫以及抵抗病原微生物入侵等功能具有重要作用。本实验中添加棉籽糖可以显著增加杂交鲟血清中髓过氧化物酶活性，与Cha等的研究结果类似。这说明，本实验添加的棉籽糖能被机体免疫系统所识别，可以有效地刺激巨噬细胞的活化，进而促进了白细胞中O2-的生成，从而增加了髓过氧化物酶的活性。

综上所述，在饲料中添加适量的棉籽糖可以显著提高杂交鲟的生长性能和呼吸爆发、髓过氧化物酶活性，但投喂时间及棉籽糖的添加量需进一步研究及优化。