多发性骨髓瘤患者血清miRNA-181a水平与病理特征的关系

严笑　欧阳桂芳　徐凯红　胡丽庆

[摘要] 目的 探討多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）患者血清miRNA-181a（miR-181a）水平与病理特征的关系。方法 选取2013年4月～2015年4月我院收治的MM患者50例作为MM组，收集患者的病理特征资料，包括性别、年龄、体质指数、首诊症状、骨髓瘤骨病（myeloma bone disease，MBD）分级、国际分期系统（international staging system，ISS）分期、体力状况评分[采用美国东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）评分标准]、分型以及血清miRNA-181a水平。选取同期于我院体检的体检者50例作为体检组，比较两组血清miRNA-181a水平，采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic，ROC）分析血清miRNA-181a对MM的预测价值。利用Spearman检验分析血清miRNA-181a与病理特征的关系。 结果 MM组血清miR-181a水平高于体检组，差异有统计学意义（P<0.05）。血清miR-181a预测MM的曲线下面积为0.668（标准误=0.053，P=0.004，95%CI=0.563～0.772）。血清miRNA-181a低表达者的骨病A级、ISSⅠ期占比分别为58.33%、58.33%，高于miRNA-181a高表达者的10.53%、7.89%，差异有统计学意义（P<0.05）。Spearman检验提示血清miRNA-181a表达水平与MM患者的骨病MBD分级、ISS分期呈正相关（P<0.05）。 结论 与健康体检者相比，MM患者的血清miRNA-181a水平明显增高，且与骨病MBD分级、ISS分期有相关性。

[关键词] 多发性骨髓瘤;病理特征;miRNA-181a;相关性

[中图分类号] R733.3          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）22-0009-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between serum miRNA-181a（miR-181a） level and pathological features in patients with multiple myeloma（MM）. Methods 50 patients with MM admitted to our hospital from April 2013 to April 2015 were selected as the MM group. The pathological characteristics of the patients were collected， including gender， age， body mass index， first diagnosis， myeloma bone disease（MBD） grading， international staging system（ISS） staging， physical status score[using Eastern Cooperative Oncology Group（ECOG）scoring criteria]， typing， and serum miRNA-181a levels. 50 patients with physical examination in our hospital were selected as the physical examination group. Serum miRNA-181a levels were compared between the two groups. The receiver operating characteristic（ROC） was used to analyze the predictive value of serum miRNA-181a for MM. The relationship between serum miRNA-181a and pathological features was analyzed by Spearman test. Results The serum miR-181a level in the MM group was higher than that in the physical examination group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The area under the curve of serum miR-181a predicted MM was 0.668（standard error=0.053，P=0.004，95%CI=0.563-0.772）. The percentages of bone disease grade A and ISS stage Ⅰ in low expression of miRNA-181a patients were 58.33% and 58.33%， respectively，which were higher than those of miRNA-181a high expression patients（10.53%， and 7.89%）. The difference was statistically significant（P<0.05）. Spearman test showed that serum miRNA-181a expression level was positively correlated with MBD grade and ISS stage of MM patients（P<0.05）. Conclusion Compared with healthy subjects， serum miRNA-181a level is significantly higher in MM patients and it is correlated with MBD grading and ISS staging.

[Key words] Multiple myeloma;Pathological features;MiRNA-181a;Correlation

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）以中老年者居多，其是一种恶性浆细胞病，临床症状包括贫血、反复感染、高钙血症、广泛性骨质破坏等[1]。研究表明MM在西方国家血液恶性瘤中占比约为10%，发病率、死亡率均较高[2]。目前，临床针对MM的治疗已提出了多种方式，然而，治疗效果并不理想，复发率高，且易出现耐药性，对患者预后影响非常大[3-4]。因此，临床必须寻求新的治疗方向，便于进一步改善预后。近年来，研究发现部分微小RNA（miRNA）在恶性瘤中呈异常表达，如miRNA-181a（miR-181a）作为miR-181家族的重要成员，可能与自身免疫疾病、恶性瘤进展密切相关[5]。本次研究旨在分析MM患者血清miR-181a水平与病理特征的关系，便于为该病诊疗提供依据，提出更具针对性的治疗策略，改善预后，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年4月～2015年4月我院收治的MM患者50例作为MM组，选取同期于我院体检的体检者50例作为体检组。MM组男27例，女23例，年龄40～76岁，平均（64.32±10.48）岁;体质指数18～26 kg/m2，平均（22.53±2.12）kg/m2;骨髓瘤骨病（myeloma bone disease，MBD）分级：A级11例、B级23例、C级12例、D级4例;类型：IgA型14例、IgG型23例、轻链型9例、其他4例;首诊症状：贫血12例、骨痛28例、球蛋白增高7例、其他3例;ISS分期：Ⅰ期10例、Ⅱ期26例、Ⅲ期14例;体力状况评分[采用美国东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）评分标准]：<2分41例，≥2分9例。體检组男24例，女26例，年龄37～75岁，平均（62.89±12.16）岁;体质指数18～26 kg/m2，平均（22.49±2.08）kg/m2。研究方案经本院伦理委员会通过，两组性别、年龄、体质指数比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准 （1）MM组：①符合《中国多发性骨髓瘤诊治指南（2011年修订）》[6]中的诊断标准，临床诊断明确;②入院前无抗骨髓瘤治疗史;③无凝血功能障碍;④精神、认知功能正常;⑤知情同意。（2）体检组：①无血液系统疾病;②无恶性肿瘤;③机体状态良好;④性别、年龄、体质量与MM组匹配;⑤知情同意。

1.2.2 排除标准  （1）无白血病等其他血液疾病;（2）肝、肾、脑等脏器严重损害;（3）血清标本不合格;（4）临床资料不完整。

1.3 检测方法

主要仪器包括定量PCR仪（美国Bio-rad伯乐T100型）、全自动生化分析仪（贝克曼库尔特公司AU5800系列）、电泳分析仪（美国bio-rad|Biorad）。主要试剂包括miRNA提取试剂盒（上海恪敏生物科技有限公司）、乳酸脱氢酶（上海索宝生物科技有限公司）、引物（上海赛信通生物试剂有限公司）、逆转录试剂盒（上海赛信通生物试剂有限公司）。所有受检者均于入院当日采集5 mL血液标本，利用离心机离心5 min（3500 r/min），分离血清，置于EP管内，存放于-80℃冰箱。参考试剂说明书对血清miRNA进行提取，以U6为内参。经PCR扩增仪扩增，miR-181a上、下游引物分别如下：5-AACATTCAACGCTGTCGGTGAGT-3、5-GTGCAG-GGTCCGAGGT-3，U6上、下游引物分别如下：5-CGCTTCGGCAGCACATATA-3、5-TTCACGAATT-TGCGTGTCAT-3。PCR反应条件：94℃ 3 min，94℃ 20 s，60℃ 40 s，循环45次，按照2-△Ct计算miR-181a相对定量。

1.4 观察指标

比较MM组、体检组的血清miR-181a水平，利用受试者工作特征曲线（ROC）分析血清miRNA-181a对MM的预测价值。并收集MM患者的临床资料，包括性别、年龄、肾功能不全、首诊症状、骨病MBD分级、ISS分期、体力状况评分（ECOG）、分型、血清miRNA-181a水平，利用Spearman检验分析血清miRNA-181a与病理特征的关系。

1.5 统计学方法

经SPSS20.0统计软件分析临床资料，计数资料用（%）表示，采用χ2检验，计量资料用（x±s）表示，采用t检验，经ROC曲线血清miRNA-181a对MM的预测价值，采用Spearman检验分析血清miRNA-181a与病理特征的关系，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MM组、体检组的血清miR-181a比较

MM组血清miR-181a水平为（0.005～0.595）-△Ct，平均（0.074±0.016）-△Ct。体检组血清miR-181a水平为（0.001～0.012）-△Ct，平均（0.005±0.003）-△Ct。MM组血清miR-181a水平高于体检组，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 血清miR-181a对MM的预测价值分析

通过绘制ROC曲线，发现血清miR-181a预测MM的曲线下面积为0.668（标准误=0.053，P=0.004，95%CI=0.563～0.772），最佳截断值为0.071-△Ct，敏感度为62.70%，特异度为63.30%。ROC曲线见图1。

2.3 MM患者血清miRNA-181a与病理特征的关系

以上述分析得出的miRNA-181a最佳截断值为界，将≥0.071-△Ct作为高表达，<0.071-△Ct作为低表达。miRNA-181a低表达者的骨病A级、ISSⅠ期占比分别为58.33%、58.33%，高于miRNA-181a高表达者的10.53%、7.89%，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.4 MM患者血清miRNA-181a与病理特征的相关性

采用Spearman检验提示血清miRNA-181a表达水平与MM患者的骨病MBD分级、ISS分期呈正相关（P<0.05），与性别、年龄、体质指数、类型、首诊症状、ECOG评分无明显相关性（P>0.05）。见表2。

3 讨论

MM的发病机制非常复杂，目前，临床认为MM恶性克隆主要与B细胞发育环境异常、遗传学改变等因素相关，具体影响机制尚未彻底明确，还有待进一步证实[7-8]。有学者发现miRNA对细胞发育进展影响较大，其可调控肿瘤细胞，促进其增殖或凋亡[9]。现已有研究证实miRNA对多种恶性肿瘤有调控作用，如胰腺癌、肺癌等[10]。miR-181a与造血功能存在关联，其参与了急性白血病的进展，且与患者预后密切相关[11]。本研究发现与体检者相比，miR-181a在MM患者血清中的表达水平明显增高，提示miR-181a可能参与了MM病情进展。有学者发现miR-181a在MM细胞株以及骨髓中呈高表达，也表明miR-181a高表达与该病存在关联[12]，为本研究提供了理论支持。

本研究通过绘制ROC曲线，发现血清miR-181a水平对MM具有一定预测价值，临床可将其作为诊断MM的重要指标。研究表明miR-181a可能具有致癌作用，P300/CBP作为其靶基因，在癌症患者的大部分细胞株中存在表达丢失现象，miR-181a表达越高，则越有利于癌细胞株生长[13-14]。另有研究提示miR-181a可能对凋亡蛋白有抑制作用，从而促使瘤体抗凋亡作用增强，但其具体机制尚未彻底明确，未来还需进一步证实[15-16]。

本文发现miRNA-181a低表达者的骨病MBD分级以A级为主，ISS分期以Ⅰ期为主，而miRNA-181a高表达者骨病MBD分级以B级居多，ISS分期以Ⅱ期为主，最终经Spearman检验提示血清miRNA-181a水平与骨病MBD分级、ISS分期呈正相关。表明随着骨病MBD分级、ISS分期越高，患者的血清miRNA-181a水平越高。骨病MBD分级已被认为是影响MM患者预后的独立危险因素，它能反映骨骼破坏程度，骨骼破坏程度越重，则局部炎症越重，导致骨细胞更容易被吸收、溶解，骨细胞功能受到抑制[17]。ISS分期也是反映MM病情的重要指标，对预后判断有一定价值[18]。本研究提示血清miRNA-181a表达与二者呈正相关，这可能的原因在于miR-181可通过影响PI3K/Akt信号通路，继而促进肿瘤细胞增殖，增加迁移风险，导致病情加重。

研究发现miR-181上調能提高U266细胞迁徙能力，而当其下调时，则可抑制该细胞的迁徙能力，这提示靶向miR-181治疗也许能促进MM患者病情改善[19]。此外，MM治疗效果与miRNA所致的耐药机制相关，有研究提示肿瘤细胞耐药与miR-181a表达水平存在关联，通过下调miR-181a表达，能使细胞对治疗药物敏感性大大提升[20]。肿瘤细胞耐药性的产生与多种因素相关，尤其miRNA对耐药细胞株的影响非常大，且已引起临床重视，这为MM的治疗提供了依据，在日后的医学研究中可将其作为研究热点，寻求靶向miR-181a治疗方法，改善预后。

本研究的创新之处在于分析了血清miR-181a对MM的预测价值，明确了最佳截断值，并且探讨了血清miR-181a与病理特征的相关性，有利于了解疾病特征，在未来提出更具针对性的治疗策略。此外，本研究因受研究经费、病例纳入时间等影响，导致样本量少，未来还需扩大样本量，对此进行进一步证实。

[参考文献]

[1] 严志民. 免疫固定电泳技术诊断及分型多发性骨髓瘤的临床研究[J]. 中国现代医生， 2016，54（24）：25-27.

[2] Tagde A，Rajabi H， Bouillez A，et al. MUC1-C drives MYC in multiple myeloma[J]. Blood， 2016，127（21）：2587-2597.

[3] Bertolini F，Mingrone W，Alietti A，et al. Thalidomide in multiple myeloma，myelodysplastic syndromes and histiocytosis. Analysis of clinical results and of surrogate angiogenesis markers[J]. Annals of Oncology，2016，12（7）：987-990.

[4] Sonneveld P，Broijl A. Treatment of relapsed and refractory multiple myeloma[J]. Haematologica，2016，101（4）：396-406.

[5] 纪伟，吴洪坤，周琳. 多发性骨髓瘤非编码RNA的研究进展[J]. 检验医学，2018，33（3）：264-268.

[6] 中国医师协会血液科医师分会，中国多发性骨髓瘤工作组. 中国多发性骨髓瘤诊治指南（2011年修订）[J]. 中华内科杂志，2011，50（10）：892-896.

[7] Vacca A，Ria R，Semeraro F，et al. Endothelial cells in the bone marrow of patients with multiple myeloma[J]. Blood，2016，102（9）：3340-3348.

[8] Rajkumar SV. Multiple myeloma：2011 update on diagnosis，risk-stratification，and management[J]. American Journal of Hematology，2016，91（7）：719-734.

[9] 李兴，马丽娜，彭大为，等. 多发性骨髓瘤患者免疫表型及循环血miRNA表达情况研究[J]. 重庆医学，2017， 46（4）：534-536.

[10] 杨雅芝，张小燕，万倩，等. 外泌小体内miRNA在多发性骨髓瘤进展中的作用及可能机制[J]. 中国实验血液学杂志，2017，25（1）：301-305.

[11] 华佳叶，冯莹，庞缨，等. miR-181a靶向抑制ATM表达促进急性髓系白血病细胞增殖[J]. 中国实验血液学杂志，2016，24（2）：347-351.

[12] 徐艳妮，肖翠容，黄英丹，等. 循环血清中miRNA作为多发性骨髓瘤诊断标志的研究[J]. 中国实验血液学杂志，2017，25（2）：471-475.

[13] 周艺，聂玉强，林泳，等. miR-181a及其靶基因Atg5在胃癌中的表达及临床意义[J]. 胃肠病学和肝病学杂志，2016，25（3）：276-278.

[14] 毛愷，丁肖华，武莉萍，等. miR-181a靶向NRP1增强肺癌A549细胞放射敏感性观察[J]. 中华放射肿瘤学杂志，2017，26（4）：463-464.

[15] 王成德，李群，卢江龙，等. miR-181家族在胶质母细胞瘤中的表达及其临床意义[J]. 浙江医学，2017，39（18）：1518-1523.

[16] 高敬，邵秉一. miR-181a调控骨髓间充质干细胞中OPG水平及对破骨细胞活性的影响[J]. 中国细胞生物学学报，2017，39（1）：52-59.

[17] 朱尊民. 骨髓瘤骨病的发生机制及治疗进展[J]. 临床血液学杂志，2017，30（4）：517-520.

[18] 张文龙，周广宇，王婉宁，等. 117例多发性骨髓瘤患者DS分期与ISS分期比较[J]. 中国实验诊断学，2016，20（3）：445-449.

[19] 马岳，颜慕霞，骆梓燕. MiR-181a在急性髓系白血病中的表达及其对细胞增殖的影响[J]. 中国实验血液学杂志，2016，24（4）：985-989.

[20] 雷振伟，张瑜，张旭. miR-181a在人类恶性肿瘤中作用机制的研究进展[J]. 解放军医学院学报，2016，37（11）：1204-1207.

（收稿日期：2019-02-24）