cyclin D1与PD-L1在不同分子亚型浸润性乳腺癌中的表达及相关性分析△

孔令慧，王金花，郭志娟，吉茹，呼斯冷，梁俊青

内蒙古自治区肿瘤医院1病理科，2乳腺肿瘤科，呼和浩特 010020

乳腺癌主要分为管腔型乳腺癌（Luminal A型、Luminal B型）及非管腔型[人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）过表达型和三阴性]乳腺癌[1]。内分泌治疗是目前临床治疗雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性乳腺癌的主要手段，但对ER阴性或表达较低的乳腺癌治疗效果不佳，且内分泌治疗后患者易出现耐药，治疗难度增加[2-3]。细胞周期蛋白D1（cyclin D1）的异常表达可致细胞周期紊乱，增殖失调，从而使正常细胞发生癌变[4]；程序性死亡受体配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也称PD-L1）通过与T细胞、B细胞结合，抑制T细胞的增殖，对机体免疫进行负性调节，导致机体对肿瘤细胞的抵抗能力降低，促进肿瘤的复发和转移[5]。cyclin D1及PD-L1均与乳腺癌的发生和发展有着紧密的联系，但目前缺乏关于二者的相关性研究，故本研究收集78例非特殊性浸润性乳腺癌患者的乳腺癌组织标本，通过检测cyclin D1和PD-L1的表达情况，分析二者在肿瘤发展过程中的相关性，旨在为临床寻找新的分子指标，为个体诊疗提供更多方案，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月至2018年12月内蒙古自治区肿瘤医院收治的乳腺癌患者的病历资料和乳腺癌组织标本。纳入标准：术前均未行放化疗等治疗，且经病理学检查确诊为浸润性乳腺癌；病历资料完整。排除标准：特殊性浸润性乳腺癌。根据纳入及排除标准，本研究共纳入原发性非特殊性浸润性乳腺癌患者78例，均为女性，年龄38～65岁，平均年龄（52.63±6.17）岁；分子亚型：Luminal A型23例，Luminal B型29例，HER2过表达型15例，三阴性11例。

1.2 检测及评价方法

采用免疫组化法对浸润性乳腺癌患者的乳腺组织进行分析。提取患者病理组织并制作切片，行免疫组化EnVision两步法染色（德国Leica公司的Leica BOND MAX型免疫组化自动染色仪），分别采用兔抗人cyclin D1单克隆抗体（ZA-0101）、鼠抗人PD-L1单克隆抗体（ZA-0170）、ER单克隆抗体（ZM-0104）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）抗体（ZM-0215）、Ki-67单克隆抗体（ZM-0165）、HER2抗体（ZM-0065）检测cyclin D1、PD-L1、ER、PR、Ki-67、HER2在病理组织中的表达情况，所有抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；对于HER2（2+）的标本进行荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）检测（试剂盒购自广州安必平医药科技股份有限公司）。根据上述指标的表达情况，将浸润性乳腺癌进行分型：Luminal A型[ER（+）/PR（+）、HER2（-）、Ki-67＜20%]；Luminal B型[ER（+）/PR（+）、HER2（-）、Ki-67≥20%；ER（+）/PR（+）、HER2（+）]；HER2 型[ER（-）、PR（-）、HER2（+）]；三阴性[ER（-）、PR（-）、HER2（-）]。cyclin D1及PD-L1阳性表达判定标准：cyclin D1阳性细胞＞5%记作阳性，PD-L1阳性细胞＞1%记作阳性。比较不同分型浸润性乳腺癌中cyclin D1及PD-L1的表达情况。参考第7版美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）TNM分期标准[6]对所有患者进行病理分期。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法，相关性分析采用Spearman等级相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同分子亚型原发性浸润性乳腺癌中cyclin D1与PD-L1表达情况的比较

不同分子亚型原发性浸润性乳腺癌中cyclin D1、PD-L1表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。三阴性乳腺癌中PD-L1阳性表达率高于Luminal A型乳腺癌，差异有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 不同分子亚型原发性浸润性乳腺癌中cyclin D1与PD-L1阳性表达情况的比较[n（%）]

2.2 不同临床特征原发性浸润性乳腺癌患者乳腺癌组织中cyclin D1及PD-L1表达情况的比较

TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、ER阳性原发性浸润性乳腺癌患者乳腺癌组织中cyclin D1阳性表达率高于TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、ER阴性患者，差异均有统计学意义（χ2=10.405、6.303，P＜0.05）；TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、ER阴性原发性浸润性乳腺癌患者乳腺癌组织中PD-L1阳性表达率高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、ER阳性患者，差异均有统计学意义（χ2=5.015、6.019，P＜0.05）；不同年龄、肿瘤大小、月经状态原发性浸润性乳腺癌患者乳腺癌组织中cyclin D1、PD-L1阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表2 不同临床特征原发性浸润性乳腺癌患者乳腺癌组织中cyclin D1及PD-L1的阳性表达情况

2.3 cyclin D1与PD-L1在原发性浸润性乳腺癌中表达的相关性分析

经Spearman等级相关分析，在原发性浸润性乳腺癌中，cyclin D1与PD-L1表达呈负相关（r=-0.436，P=0.021）。

3 讨论

乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，以女性居多，常伴有乳腺肿块、皮肤改变及乳头乳晕异常等临床表现[7]。当肿瘤细胞失去了正常细胞的特性，细胞之间的连接松散，肿瘤细胞容易发生脱落，游离的肿瘤细胞随血液及淋巴液播散全身，造成转移[8]。目前，乳腺癌分子分型结合特异性生物分子的靶向治疗已成为研究热点。

由于基因的异常激活或失活、过度表达或缺失，导致人体内细胞增殖异常，发生恶变，使正常细胞成为肿瘤细胞。cyclin D1是一种细胞周期调控基因，其通过缩短细胞G1期，使细胞对分裂原的需求降低，提前进入S期，促进DNA的合成，推动细胞周期的进程，导致细胞增殖失控和癌变，在王竞伟等[9]对cyclin D1与乳腺癌相关研究分析中也有提到，cyclin D1表达水平越高，肿瘤细胞增殖越快。本研究中，cyclin D1在各型乳腺癌患者中的阳性表达情况无差异，cyclin D1阳性表达与TNM分期及ER状态有关。已有研究证实，cyclin D1与ER呈正相关，ER能够诱导cyclin D1的过表达，cyclin D1也能够通过与激素结合区结合激活ER，刺激ER的阳性表达[10]。Luminal A型乳腺癌以ER阳性表达为主要特征，Luminal B型乳腺癌虽然ER也呈阳性表达状态，但其表达强度没有Luminal A型高，因此Luminal A型乳腺癌患者cyclin D1表达水平最高[11]。陈春兵等[12]对cyclin D1水平与不同分子分型浸润性乳腺癌的研究提出，cyclin D1阳性表达水平越高的患者，生存时间越长。乳腺癌是一种激素依赖性肿瘤，临床可对cyclin D1阳性表达水平高的患者予以针对性的内分泌治疗，通过调节患者体内激素水平，控制肿瘤细胞的生长和发展，延长患者生存时间。

程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PDCD1，也称PD-1）作为共刺激分子家族中的一员表达于多种肿瘤细胞表面，在T细胞、B细胞活化中起着重要作用，PD-L1是PD-1的配体，其能够通过结合活化T细胞、B细胞的PD-1，抑制T细胞的增殖和细胞因子的分泌，导致机体T细胞失去免疫作用，增加肿瘤细胞的恶性程度，引起肿瘤细胞的复发和转移[13]。本研究中，三阴性乳腺癌中PD-L1阳性表达率高于Luminal A型乳腺癌，PD-L1表达阳性与TNM分期及ER状态有关。三阴性乳腺癌是一种ER、PR、HER2均为阴性的乳腺癌，同时也被称为是一种免疫原性肿瘤[14]，目前常规的靶向内分泌治疗对其无明显作用，PD-L1在肿瘤细胞的增殖中通过弱化细胞的免疫原性，促进肿瘤细胞的免疫逃逸、增殖和转移，故其在三阴性乳腺癌中的表达水平更高，同时PD-L1增加了肿瘤细胞对正常细胞组织的侵袭性，故PD-L1表达水平高的乳腺癌恶性程度高，这也符合三阴性乳腺癌的临床特点，故可将PD-L1作为治疗三阴性乳腺癌的新靶点，这与Mittendorf等[15]研究结果一致。但在张亚和彭成浩[16]对乳腺癌中PD-1/PD-L1的表达水平及意义的研究中提出PD-L1的表达水平与ER、PR等受体表达水平无显著关系，这与本次研究所得结论相悖，具体结果仍需进一步讨论研究。

本研究对cyclin D1和PD-L1的相关性进行分析，发现在原发性浸润性乳腺癌中，cyclin D1水平与PD-L1水平呈负相关。ER能够引导cyclin D1的高表达，cyclin D1的高表达又同时刺激ER水平的增加，组织分化程度高，则肿瘤恶性程度相对较低，患者预后较好[17-18]。而PD-1/PD-L1通路通过对机体免疫进行负性调节，导致肿瘤特异性T细胞不能抑制肿瘤细胞的生长，并使肿瘤细胞产生了免疫耐受，从而加快了肿瘤细胞的增殖速度，更易发生转移，肿瘤的恶性程度也更高，患者预后更差[19-20]。

综上所述，在原发性浸润性乳腺癌中，cyclin D1水平与PD-L1水平呈负相关，且cyclin D1阳性表达与TNM分期低及ER阳性有关；PD-L1在三阴性乳腺癌中呈高表达，其在乳腺癌组织中的阳性表达与TNM分期高及ER阴性有关。