夏季不同时期浮床植物旱伞草和美人蕉对铜绿微囊藻的化感作用研究

潘 琦，刘娅琴，邹国燕，周文宗，付子轼，刘长娥，宋祥甫

（上海市农业科学院，上海201403）

日益加剧的水体富营养化促使水域中的藻类大量繁殖，而藻类失控的暴发性生长会引发水华的形成，大量消耗水体中的溶解氧，其直接后果便是造成水生动物的窒息死亡，给水产养殖带来不可估量的损失。藻类产生的藻毒素，其危害不仅仅是引起动物的中毒，还可以通过食物链威胁人类的健康，甚至引发生态系统失衡，因此水环境的污染已经成为当今人类亟待解决的严峻问题［1］。生态浮床利用水上种植技术，通过陆生植物根系的吸附和吸收作用，富集水中氮、磷等元素，降解和富集其他有害有毒污染物，并以收获植物体的形式将其搬离水体，从而实现净化水体、保护水生态环境的目的。实践证明，生态浮床技术在治理富营养化水体方面效果显著［2-4］。

国内外利用植物化感物质抑制藻类的研究比较多，但多集中在水生植物对藻类的化感作用上［5-9］，大型陆生植物对藻类化感作用的研究较少。本研究利用生态浮床技术，以生长速度快、净化水质能力强的陆生植物美人蕉和旱伞草为供试植物，在其生长最为旺盛，同时也是水华最易暴发的6—8月进行试验，研究夏季不同生长时期两种美人蕉和旱伞草生长及其对蓝藻水华的主要组成者铜绿微囊藻的影响，并利用GC-MS分析其根系分泌的化学物质，为进一步探讨陆生植物对藻类的抑制机理奠定基础。

1 材料方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料

旱伞草（CyperusalternifoliusL.）、美人蕉（CannaindicaL.）、黄花美人蕉（C.indicaL.var.flavaRoxb.）培育于上海市陆家浜河道，试验前洗净植物根系，将其移植到大棚水泥池，采用Hoagland营养液培养1 d。

1.1.2 铜绿微囊藻

铜绿微囊藻（Microcystisaeruginosa）由中国科学院水生生物研究所淡水藻种库提供，藻类试验起始浓度约为2×105个/mL。

1.2 试验方法

1.2.1 植物种植水的制作

根据浮床植物美人蕉等的生长特点及其对水体氮磷吸收的最佳时间段［10-11］，在温室大棚内进行植物种植水的制作。6月15日开始挑选大小和重量基本一致的旱伞草、美人蕉、黄花美人蕉，种植于大棚内的水泥池。分4期（6月15日，7月3日，7月21日，8月10日）从每种植物中各取两株，将其根系用蒸馏水洗净，单株种植在盛有8 L 1/20 Hoagland营养液的塑料桶中培养，供后续试验用。每期各品种设2个重复，定期补充蒸馏水以消除植物蒸腾和水分蒸发对试验效果的影响。植株在塑料桶中培养72 h，收集该植物的种植水，进行根系分泌物的抑藻试验。考虑到后续三期植物根系生长迅速，根系分泌物质产生也较多，所以以第一期取样时植物的根/水浓度比例［根系重量（g）/种植水体积（L）］作为旱伞草和美人蕉的标准根系单位浓度，对余下三期水样进行稀释，使4期最终的种植水根系单位浓度一致，便于在同等条件下，对各期种植水的抑藻效果进行比较。取样完毕后，将每株植物的根系和地上部放置于烘箱内，70°条件下烘干至恒重，冷却后分别称量干物重。

1.2.2 植物种植水抑藻效果试验

取种植水1 L，用WATERMAN滤膜（孔径0.90μm）抽滤后，滤液加CB培养液100mL，在超净工作台上抽滤灭菌后，量取10 mL，倒入灭过菌的三角锥形瓶中，每种植物种植水设3次重复，空白对照仅添加10 mL CB培养液。

向各处理中添加100μL铜绿微囊藻，置于培养箱中，温度为25℃，光照强度为3 000 lx，光暗比为12 h∶12 h，80 r/min震荡培养，每5 d用血球计数板记录藻类数量。同时，采用分光光度法［12］测定铜绿微囊藻叶绿素a的含量。种植水对藻类的抑制率（RI）：RI＝（1-N/N0）×100%。式中：N为种植水组藻密度；N0为对照组藻密度。

1.2.3 根系分泌物的收集浓缩

种植水经滤膜抽滤后，滤液用浓盐酸调节至pH 1.5，取150 mL进行固相萃取。

使用Oasis HLB固相萃取柱，先用4 m甲醇活化柱子，再用4mL pH 1.5盐酸清洗，种植水以3 mL/min的速度过柱后，用4 mL pH 1.5盐酸洗柱。待水完全抽干后，用20 mL甲醇洗脱柱子上的提取物。无水硫酸钠处理脱水，旋转蒸发仪浓缩至5 mL。

1.2.4 GC-MS处理分析

取浓缩后的根系分泌物2 mL，45℃下氮气吹干，加入100μL BSTFA和200μL正己烷，封管，120℃反应30 min，取1.0μL反应液进行GC-MS分析。

GC-MS测定的条件为：检测仪器Finnigan Voyager气相色谱-质谱联用仪，色谱柱VF-5 ms，石英毛细管柱30 m×0.25 mm；柱温80℃（保持2 min），以20℃/min的速率升至300℃（保持10 min），汽化温度250℃；载气流量 He（1.0 mL/min）；分流比20∶1；进样量1.0μL；质谱检测器：EI源，电子能量70 eV，源温200℃。植物根系分泌物的定性根据质谱图与Wiley 7.0标准质谱数据库对照［13］。

1.2.5 数据处理

使用SPSS 9.0软件进行数据处理与分析。

2 结果与分析

2.1 旱伞草和两种美人蕉植物生长情况的比较

如表1所示，第四期（8月10日）旱伞草、美人蕉和黄花美人蕉生物量干重分别是第一期（6月15日）6.9倍、4.6倍和5.3倍，根系分别为7.5倍、2.5倍和3.0倍。通过吸收水体氮磷，旱伞草和两个品种的美人蕉生物量增加显著。其中，旱伞草生长迅速，生物量变化最大，黄花美人蕉其次，美人蕉最小。

表1 不同取样时期各植物的生物量Table 1 Biomass of plants in each period

2.2 旱伞草和两种美人蕉种植水对藻类生长的影响

图1显示，旱伞草和美人蕉各期种植水对铜绿微囊藻生长均有一定的抑制效果，说明旱伞草和美人蕉根系分泌了某些抑制铜绿微囊藻生长的物质。第一期3种植物种植水对铜绿微囊藻的抑制作用较好，随着培养时间的延续，种植水中藻类数量增加缓慢，旱伞草和两种美人蕉种植水对铜绿微囊藻的抑制效果差异不显著。但在其后的第二、三、四期培养过程中，可以明显看出旱伞草的抑藻效果弱于美人蕉，两种美人蕉对铜绿微囊藻的抑藻效果差异较小。第四期藻类共培养试验中，旱伞草种植水对铜绿微囊藻的生长抑制效果已十分微弱，美人蕉和黄花美人蕉则仍保持一定的抑藻效果。整个试验期间旱伞草生物量及根系生长最迅速，其种植水抑藻效果却低于美人蕉，美人蕉和黄花美人蕉生物量和根系生长虽有差异，但两种植物种植水对藻类抑藻效果差异不显著。可见植物种类不同，营养生长阶段其根系分泌物的抑藻效果也有差异。

图1 铜绿微囊藻在3种植物种植水中培养20 d生长曲线变化Fig.1 The grow th curves of M icrocystis aeruginosa w ith the roots exudates of three p lants in 20 days

叶绿素a是反映藻类能否正常生长及光合作用的重要指标之一。本试验中，对照组铜绿微囊藻的叶绿素a含量分别是旱伞草、美人蕉和黄花美人蕉种植水的1.47倍、1.98倍和2.53倍，差异显著（P＜0.05）。由此推测，3种植物种植水是通过破坏藻类叶绿素a的合成来影响铜绿微囊藻正常生长的。

2.3 植物不同生长时期3种植物种植水对藻类生长的影响

从图2可以看出，第一期旱伞草种植水对铜绿微囊藻的化感作用最好，其抑制率最高达到了56.3%，并且种植水培养藻类时间越长，抑藻效果越明显。两种美人蕉种植水相比，其对藻类的抑制效果无显著差异，抑制率均在培养10—15 d达到最大值，第一期的抑制率最高，美人蕉达到了64.2%，黄花美人蕉为67.7%。上述结果表明，相同的单位根系浓度下，开始时，旱伞草根系产生和释放的对铜绿微囊藻具有抑制作用的化感物质成分或含量相对较高，进入生长旺季，旱伞草植株质量增加，根系分泌物的化感物质成分或含量相对减少。而两种美人蕉植株生物量增加，根系分泌物对铜绿微囊藻的化感作用则无显著变化。综上，旱伞草植株生物量增加，其根系种植水对铜绿微囊藻的化感作用显著降低，而美人蕉生长各期其种植水的化感作用无显著变化。

图2 不同生长时间旱伞草和两种美人蕉抑藻效果比较Fig.2 Inhibit ratios of the roots exudates of three plants on the algal grow th of M icrocystis aeruginosa

2.4 GC-MS测定分析

本研究以第一期旱伞草和美人蕉种植水中提取的根系分泌物为代表，用GC-MS对分泌物的化学成分进行分析。结果表明，旱伞草根系分泌物检测出11种化合物，美人蕉检测出10种化合物（表2），两种植物分泌物的化学成分多为脂肪酸和醇类化合物。与空白对照相比，3种植物的种植水中藻类叶绿素a含量下降显著。由此推测，种植水对铜绿微囊藻的抑制作用，也是通过植物根系分泌的化合物破坏藻类叶绿素的合成来实现的。

表2 GC-MS分析检测旱伞草和美人蕉根系分泌物中所得化学物质Table 2 Compounds of roots exudates Cyperus alternifolius and Canna indica tested by GC-MS

3 讨论

本试验通过收集植物种植水获得根系分泌物，并用无菌种植水添加藻种的方式进行培养，避免了植物与藻类共培养而引发的光照竞争、营养竞争及微生物干扰等因素，确保试验中铜绿微囊藻生长变化只受植物根系分泌物影响。

化感物质通过破坏藻类叶绿素、减少其同化产物的方式抑制藻类生长，如粉绿狐尾藻可破坏胞藻的叶绿素a和藻胆蛋白的特征吸收峰，降低藻细胞对光的吸收能力［14］。水生植物可以通过减少藻类细胞叶绿素含量、降低光合速率、严重损伤藻类类囊体反应来抑制藻类光合作用，如凤眼莲根系分泌物可使栅藻叶绿体解体，黑藻与铜绿微囊藻共培养时，微囊藻细胞叶绿素a含量显著低于对照［15-16］。本试验中美人蕉和旱伞草种植水也对叶绿体a有较大的抑制作用，与凤眼莲、黑藻对铜绿微囊藻生长的抑制效果一致。另有研究认为，植物化感物质对藻类的抑制作用主要体现在影响藻类光合作用、酶活性、细胞亚显微结构、蛋白质合成，改变核酸代谢以及破坏细胞膜等［17］。浮床美人蕉和旱伞草对藻类在生理生化方面的影响，还有待做进一步深入的研究。

旱伞草和美人蕉种植水中都含有的棕榈酸对小球藻和和斜生栅藻具有很好的抑制作用。戴树桂等［18］研究表明，棕榈酸对藻类的半抑制剂量为 8.2 mg/mL。Nakai等［19］从穗花狐尾藻（Myriophyllum spicatum）浸提液中，分离得到了包括棕榈酸和硬脂酸在内的多种脂肪酸类物质，棕榈酸等物质对铜绿微囊藻具有抑制作用。张庭廷等［20］研究发现己酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸等脂肪酸对铜绿微囊藻、蛋白核小球藻及斜生栅藻均有抑制作用，乳酸、十五酸等也被证实具有抑藻活性［21-22］。倪利晓等［23］也认为多种脂肪酸组合具有协同抑藻作用。陈国元等［24］发现黄菖蒲有机酸组份的存在影响藻类正常的光合作用。

水生植物如穗状狐尾藻和芦苇均对铜绿微囊藻具有化感作用，但穗状狐尾藻产生的化感物质为鞣花酸、五倍子酸和焦棓酸等［25］，芦苇中起化感作用的物质是2-甲基乙酰乙酸乙酯（EMA），两种植物起化感作用的成分不同［26］。本试验检测出的两种植物大部分化合物相同，与前人研究结果不一致。由此推测，不同植物种类特别是陆生植物与水生植物的分泌物不同。本试验中，美人蕉和旱伞草分泌相同或相似的化合物，这可能是受环境影响，也有可能是均属陆生植物所致。但由于植物种类不同，其根系分泌物也存在一定的差别，因此，种植水抑制铜绿微囊藻化感效果存在一定的差异。

与第一期比较，最后一期总生物量和根系生物量均成倍的增加。6—8月份是浮床美人蕉和旱伞草旺盛生长阶段，也是水华发生盛期［27-29］，将陆生植物通过生态浮床的方式种植于富营养化水体中，既能吸收利用水体中多余的氮磷营养元素，达到净化水质的目的，同时，植物根系分泌的化感物质也可有效抑制藻类的繁衍和水华的暴发。本试验条件下，单位根系浓度美人蕉的抑藻效果比旱伞草显著，但旱伞草生物量增长高于美人蕉。因此，在将浮床植物应用于富营养化水体控制时，需根据不同需求来选择植物种类和品种。本研究后续将开展检出的未知毒性化合物对藻类的抑制效果以及相关生理生化研究。

4 结论

1.旱伞草和美人蕉、黄花美人蕉种植水对铜绿微囊藻的生长有较好抑制作用，其抑制率最高分别达到56.3%，64.2%和67.7%。第一期试验中对照组铜绿微囊藻叶绿素a含量分别是旱伞草、美人蕉和黄花美人蕉种植水的1.47倍、1.98倍和2.53倍。

2.试验第四期（8月10日）旱伞草、美人蕉和黄花美人蕉干物重分别是第一期（6月15日）的6.9倍、4.6倍和5.3倍，根系分别为7.5倍、2.5倍和3.0倍。随着供试植物质量的增加，在相同单位根系浓度种植水中，旱伞草对铜绿微囊藻的化感作用逐渐减弱，美人蕉则持续保持较好的抑制效果，两种美人蕉间对藻类的抑制效果差异不显著。

3.用GC-MS对旱伞草和美人蕉种植水提取物进行分析，旱伞草根系分泌物中含有棕榈酸等11种化合物，美人蕉根系分泌物中有棕榈酸和硬脂酸等10种化合物。

致谢：感谢日本广岛大学大学中井智司（Nakai Satoshi）教授为本试验提供的技术支持和帮助。