人参皂苷Rg1微球的制备及实验优化

杨 丹 ，黄 娟 ，彭 娟 ，程 映 ，姜 岚 （通讯作者）

（1玉溪师范学院化学生物与环境学院 云南 玉溪 653100）

（2昆明医科大学第一附属医院超声科/云南省超声诊断质量控制中心/云南省超声影像研究中心云南 昆明 650032）

人参皂苷Rg1来源于人参属植物的提取物，是四环三萜类衍生物，研究证实，人参皂苷Rg1具有促进海马神经发生、改善记忆力、抗胆碱、抗氧化等作用[1-4]。但是研究显示，人参皂苷Rg1无法通过血脑屏障实现良好的脑疾病的治疗作用[5]，并且其在体内容易被降解，半衰期短，同时血脑屏障制了其入脑。载药纳米粒能够实现对药物的保护、缓释和靶向输送。PLGA是一种可降解的功能高分子有机化合物，具良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域，国内外有很多学者们研究使用PLGA作为壳载体来包埋亲水性药物制作纳米微球本研究使用PLGA作为载体材料携带人参皂苷Rg1，以包封率及平均粒径为指标，采用正交实验寻求最优制备条件。

1 资料与方法

1.1 试剂与仪器

聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA，分子量，LA：GA=50:50，Aladdin industrial Corporation）/ 人参皂苷Rg1（上海源叶生物科技有限公司）、聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，PVA，Sigma-Aldrich Corporation）二氯甲烷、乙腈。超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司，SCIENTZ-IID）、高效液相色谱仪（Agilent 1260 Infinity）、Hypersil GOLD液相色谱柱（250×4.6mm×5um，Thermoscientific）、Malvern激光粒度分析仪、磁力搅拌器（温州标诺仪器有限公司，78-1）、低温冷冻离心机（Allegra® X-15R）、超纯水仪（西安优普仪器设备有限公司，UPT-I-5/10/20T）、电子天平（Precisa ES225SMDR）。

1.2 实验方法

制备及参数优化：采用复乳-溶剂挥发法制备以PLGA为携人参皂苷Rg1载体的纳米粒微球。精密称取相应质量的PLGA并放入相应体积的二氯甲烷中，振荡使其充分溶解，制成油相O；称取一定质量的人参皂苷Rg1并制成相应浓度的水溶液作为内水相W1；配置1%PVA水溶液为外水相W2。混合W1相与O相，并将其置入超声波细胞粉碎机行第一次超声乳化（300W，T1），制得初乳（W1/O），后将初乳W1/O快速加入外水相W2中，再次置入超声波细胞粉碎机进行第二次超声乳化（300W，T2），即可得到复乳。将得到的复乳于室温下搅拌4小时，使有机溶剂充分挥发，既得人参皂苷Rg1纳米粒混悬液。将上述液体分装入离心管内，4000r/min离心5min，收集上清，蒸馏水洗涤三次并离心收集全部上清。离心洗涤后的沉淀干燥后收集既得干粉，置4℃冰箱中保存、备用。在前期预实验单因素分析后筛选出在制备过程中对包封率及粒径有影响的五种因素，X1（O相PLGA浓度，mg/ml）、X2（W1与O体积比）、X3（W2与W1/O体积比）、X4（第一次超声乳化时间，T1）、X5（第二次超声乳化时间，T2）；每个因素选4个水平，按L16（45）正交表安排实验，水平重复每一相同实验三次。见表1。

表1 正交实验因素水平表

1.3 含量测定

使用高效液相色谱仪（Agilent 1260 Infinity）及Hypersil GOLD液相色谱柱（250×4.6mm×5um，Thermoscientific）。乙腈为A相，水为B相，按照表二进行梯度洗脱；进样量20ul；流速1.0ml/min；检测波长203nm。

表2 含量测定

1.4 标准曲线的制备

分别称取一定质量人参皂苷Rg1，配制不同浓度Rg1溶液，按照前述1.3下色谱条件得到的结果，以峰面积（A）对质量浓度（ρ）进行线性回归，得到人参皂苷Rg1标准曲线：A=3.6654ρ-6.889（r=0.9995）。

1.5 包封率的测定

取1.2项下离心收集的所有上清，据1.3下色谱条件，测定游离药物量（cfree），按以下公式计算包封率（entrapment efficiency，EE%）=（ctotal-cfree/ctotal）×100%。

2 结果

2.1 正交实验结果及统计学分析

以正交实验各序号对应实验条件制备的人参皂苷Rg1-PLGA微球的包封率（%）及平均粒径为指标，结果如下表3～表6。

表3 人参皂苷Rg1-PLGA微球包封率单因素分析表

表4 人参皂苷Rg1-PLGA微球包封率正交实验方差分析结果表

表5 人参皂苷Rg1-PLGA微球粒径单因素分析表

表6 人参皂苷Rg1-PLGA微球粒径正交实验方差分析结果表

由上表可知，X1、X2、X3、X4、X5五个因素对包封率和粒径影响都有统计学意义（P＜0.001）。五个因素对包封率的影响依次为X2＞X1＞X4＞X5＞X3，五个因素的最佳水平分别为：X1选水平3，X2选水平3，X3选水平1，X4选水平1，X5选水平3，对应的最优条件为：PLGA浓度20mg/ml，W1:O为3:10，W2:W1/O为2:1，第一次超声乳化时间（T1）10s，第二次超声乳化时间（T2）90s；而对于粒径的影响次序，五个因素依次为X1＞X5＞X2＞X4＞X3。对于粒径来说，每个因素最佳的水平分别为：X1选水平3，X2选水平4，X3选水平1，X4选水平3，X5选水平4，即PLGA浓度20mg/ml，W1:O为2:5，W2:W1/O为2:1，第一次超声乳化时间（T1）10s，第二次超声乳化时间（T2）120s。

3 讨论

人参皂苷Rg1可溶于水[10]，并且PLGA是一种可降解的功能高分子有机化合物，在人体内可降解为无毒的物质乙酸及羟基乙酸，并且具良好的生物相容性、成膜的性能，因此被广泛应用于制药、医用工程材料领域，可用于携带水溶性药物。而复乳-溶剂挥发法可用于制备水溶性药物纳米粒。通过正交实验得出，对于包封率而言，要获得最佳包封率，载体浓度不宜过低及过高，当载体浓度过低，不足以完全包封体系中的人参皂苷Rg1，而当载体浓度过高时，由于人参皂苷Rg1浓度不变，则显得PLGA相对过多，反而包封率降低，故当PLGA浓度在30mg/ml时Rg1包封率达到最佳；而当油相与内水相体积比增大时，在一定范围内包封率上升，但当上升至一定程度时反而包封率下降，最佳的内水相与油相比值为3:10，这与文献相符，可能与体系中的水相Rg1不变时，增加成膜的PLGA则包封率上升，但当其过剩时，由于水相中的Rg1相对减少所以包封率下降。随着第一次超声乳化时间的延长，包封率反而下降，可能因为第一次乳化时间过长，增加内水相与油相的团聚机会。因此我们在外水相中加入了1%PVA作为乳化剂，其作用是提高液滴的聚结保护作用。当PLGA浓度增加时，平均粒径减小，但当初乳与外水相体积比增大，平均粒径也增加。因此本研究以PLGA为外壳材料可制备PLGA-人参皂苷Rg1纳米粒，通过正交实验能获得其包封率及平均粒径制备的最优化条件。