顶空固相微萃取-气相色谱/质谱联用法结合化学计量学分析白肋烟烘焙前后挥发性、半挥发性成分

邓 波, 王维维, 张小涛, 童福强, 姬厚伟, 刘与铭, 张 丽

(贵州中烟工业有限公司技术中心, 贵州 贵阳 550009)

白肋烟是混合型卷烟的重要原料,未经处理的白肋烟含糖量低,烟碱和总氮含量高,吸味品质表现为具有白肋烟特征香气,但余味较差,刺激性和劲头较大,地方性杂气和氨气较重[1-3]。白肋烟处理工艺是影响混合型卷烟品质的关键因素之一,主要包括重加里料和高温烘焙[4]。重加里料主要用来弥补白肋烟自身含糖量的不足,进而达到降低烟气pH、协调烟气和增加香味的作用[5];高温烘焙则有助于料液与烟叶化学成分发生焦糖化作用和美拉德反应等,产生香味物质,提高卷烟的吸食品质,且有助于减少地方性杂气、减轻刺激性和改善余味[6]。国内外对白肋烟处理工艺研究较多,主要是通过控制加料含水率、烘焙温湿度、烘焙时间、干燥终端含水率等工艺参数来控制白肋烟的处理质量,工艺参数的确定主要依赖于处理后白肋烟的评吸结果[7,8],评吸结果主观性强、易受评吸人员状态及环境影响。深入研究烘焙前后白肋烟香气成分的变化规律可为白肋烟工艺参数优化及白肋烟处理效果评价提供客观、可靠的支撑,找到适合国内白肋烟处理的最优工艺参数,进而提高混合型卷烟产品质量。

固相微萃取(SPME)具有无需前处理、样品用量少、选择性强、灵敏度高等优点,常与GC/MS联用测定挥发性、半挥发性成分[9,10],被广泛用于食品[11-14]、生物[15-17]、医学[18,19]、环境[20-22]等领域。本文采用顶空固相微萃取-气相色谱/质谱法(HS-SPME-GC/MS)技术对白肋烟中的挥发性、半挥发性成分进行测定,并采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)比较白肋烟烘焙前后化学成分的变化,为白肋烟烘焙效果的评价和白肋烟烘焙参数的优化提供有效的检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

CP224S型电子分析天平(感量0.000 1 g,德国Sartorius公司);配有TriPlus RSHTM自动进样器的Thermo Trace1310-ISQ GC-MS气相色谱/质谱联用仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)。固相微萃取纤维头:活性炭/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS),膜厚85 μm;二乙烯基苯/活性炭/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS),膜厚50/30 μm;聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB),膜厚65 μm;聚乙二醇(PEG),膜厚60 μm;聚丙烯酸酯(PA),膜厚85 μm(美国Supelco公司)。

乙酸苯乙酯(纯度99%)和79种标样(纯度均≥97%)(北京J&K公司);丙酮(色谱纯,美国TEDIA公司)。

2批次白肋烟烟叶处理过程中烘焙入口和烘焙出口各取3个样本,每个样本重复测定2次(B-1-1～B-1-6、B-2-1～B-2-6为烘焙入口样品,A-1-1～A-1-6、A-2-1～A-2-6为烘焙出口样品),所有样品研磨成粉后过40目筛,并保存于4 ℃冰箱。

1.2 SPME条件

准确称取0.020 0 g烟粉装入20 mL顶空瓶中,加入1 μL 20 μg/mL乙酸苯乙酯和氘代苯酚的丙酮溶液(内标),然后盖上磁性顶空瓶盖待测。

固相微萃取纤维头:65 μm PDMS/DVB;孵化温度:60 ℃,孵化时间:8 min,萃取时间:40 min;解吸温度:250 ℃;解吸时间:3 min;老化时间:30 min。

1.3 顶空条件

准确称取1.000 0 g烟粉样品装入20 mL顶空瓶中,加入1 μL 20 μg/mL乙酸苯乙酯和氘代苯酚的丙酮溶液(内标),然后盖上磁性顶空瓶盖待测。

样品平衡温度:80 ℃;样品平衡时间:40 min;进样方式:加压恒时;进样压力:130 kPa;进样时间:0.5 min。

1.4 GC-MS条件

色谱柱:DB-WAXETR毛细管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm);载气:高纯He,纯度99.999%;流速:1.0 mL/min;进样口温度:250 ℃;进样模式:不分流进样;升温程序:40 ℃保持2 min,以4 ℃/min的速度升至200 ℃,保持1 min,然后以10 ℃/min的速度升至240 ℃,保持10 min。

离子源:电子轰击(EI);电子能量:70 eV;离子源温度:280 ℃;传输线温度:240 ℃;质量分析器:四极杆;扫描模式:SIM+SCAN; SCAN质量扫描范围:29～400 amu。

1.5 数据分析

利用自动质谱图解卷积和鉴定系统(AMDIS)对共流出色谱峰进行解卷积,利用Xcalibur软件的processing setup编辑自动积分方法,然后利用Quan Browser功能对自动积分结果进行手动校正,生成一个包含样品信息、保留时间和相对峰面积(峰面积与内标峰面积比值)的三维矩阵。

应用SIMCA-P14.0软件(瑞士Umetrics公司)对数据进行标准化处理后,进行PCA、PLS-DA等化学计量学分析。应用SPSS19.0软件(美国IBM公司)对差异物进行t-检验。应用Multi Experiment Viewer软件(v 4.8.1)进行热图绘制。

图1 HS-GC/MS和HS-SPME-GC/MS方法分析白肋烟中挥发性、半挥发性成分的总离子流图

2 结果与讨论

2.1 分析模式的选择

HS和HS-SPME是测定挥发性成分的常用方法[23]。比较了HS和HS-SPME方法测定烟叶中挥发性、半挥发性成分的定性结果。结果表明,HS-SPME在测定烟叶挥发性、半挥发性成分种类方面具有明显优势(见图1)。由于HS无富集作用、灵敏度低,测定的挥发性、半挥发性成分非常有限,仅测到乙醛、2-甲基丙醛、丙酮、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、2,3-丁二酮、乙酸、丙二醇、烟碱、新植二烯、1,2-二乙酸甘油酯、麦斯明和二烯烟碱,且响应值相对较低。与HS-SPME方法相比,HS方法在测定乙醛、2-甲基丙醛等低沸点(100 ℃以下)成分时有利,但不能测定巨豆三烯酮、紫罗兰酮、5-羟甲基糠醛等高沸点的烟草特征香味成分,及吡啶、糠醛、丁内酯、苯乙酮等烟草中微量的香味成分。

2.2 固相微萃取条件的优化

2.2.1固相微萃取纤维头的选择

不同材质的萃取头对不同化合物的萃取效率不同。在萃取温度60 ℃,孵化时间8 min,萃取时间40 min, 250 ℃解吸3 min条件下,比较了85 μm CAR/PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、60 μm PEG和85 μm PA 5种不同纤维头对烟粉中挥发性、半挥发性成分的萃取效果(见表1)。结果表明:85 μm CAR/PDMS可以得到104个峰,其中致香成分64种;50/30 μm DVB/CAR/PDMS可以得到91个峰,其中致香成分64种;65 μm PDMS/DVB可以得到110个峰,其中致香成分78种;60 μm PEG可以得到78个峰,其中致香成分42种;85 μm PA可以得到86个峰,其中致香成分60种。由于60 μm PEG和85 μm PA极性较强,得到的色谱峰数目和致香成分数均小于其他3种纤维头,为了保证分析数据的全面性,不采用60 μm PEG和85 μm PA这两种纤维头。

表1 不同萃取纤维头条件下得到的色谱峰个数和致香成分数

CAR: carboxen; PDMS: polydimethylsiloxane; DVB: divinylbenzene; PEG: polyethylene glycol; PA: polyacrylate.

除了分析化合物的丰富性,分析精密度也是评价纤维头的一个主要因素。对85 μm CAR/PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS和65 μm PDMS/DVB 3种纤维头共有的86个色谱峰的分析精密度进行了比较,结果如表2所示。3种纤维头中,50/30 μm DVB/CAR/PDMS的分析精密度最差,65 μm PDMS/DVB比85 μm CAR/PDMS的分析精密度更好,且测定的香味成分种类更多。因此选择65 μm PDMS/DVB。

表2 不同纤维头的分析精密度

RSD: relative standard deviation of the peak areas for a component in six repeated measurements using the same fiber.

2.2.2萃取温度优化

在孵化时间为8 min、萃取时间为40 min、250 ℃解吸3 min条件下,分别考察了40、50、60、70和80 ℃时各色谱峰的相对峰面积。以5种不同极性、不同沸点的重要香味成分为例(下同),各色谱峰在不同温度条件下的相对峰面积变化如图2a所示。随温度升高,糠醛、茄酮相对峰面积依次升高;丙酸相对峰面积依次降低;苯酚、D-泛酰内酯相对峰面积先升高后降低。该结果可能与温度的动力学和热力学作用有关,温度升高有利于挥发性、半挥发性成分进入顶空相,同时不利于纤维头对挥发性、半挥发性成分的吸附。低沸点极性化合物在低温下即可达到气固平衡,而升高温度将降低其在纤维头上的吸附,因此响应出现下降趋势。而升高温度有利于高沸点化合物的挥发,响应升高[24]。为保证分析方法的全面性和灵敏度,选择萃取温度为60 ℃。

图2 萃取温度(a)、孵化时间(b)、萃取时间(c)和解吸时间(d)对白肋烟中5种重要成分相对峰面积的影响

2.2.3孵化时间的优化

在萃取前,需将样品在一定温度条件下孵化一段时间。在萃取温度为60 ℃、萃取时间为40 min、250 ℃解吸3 min条件下,分别考察了孵化2、4、6、8和10 min时各色谱峰的相对峰面积,如图2b所示。结果表明:随孵化时间延长,各色谱峰相对峰面积略有增加;孵化8 min时,糠醛、D-泛酰内酯、苯酚相对峰面积增加,茄酮和丙酸相对峰面积下降。为保证分析方法的全面性和灵敏度,选择孵化时间8 min。

2.2.4萃取时间的优化

在萃取温度为60 ℃、孵化时间为8 min、250 ℃解析3 min条件下,分别考察了萃取10、20、30、40、50、60、70、80和90 min时各色谱峰的相对峰面积,如图2c所示。随萃取时间延长,糠醛、茄酮、丙酸的相对峰面积先上升后趋于稳定;苯酚和D-泛酰内酯相对峰面积先上升,40 min后下降。因此,萃取时间选择40 min。

2.2.5解吸时间的优化

为保证各组分解吸完全,在孵化时间8 min、60 ℃萃取40 min、解吸温度250 ℃条件下,分别考察了解吸时间1、2、3、4、5和6 min时各色谱峰的相对峰面积。结果如图2d所示,解吸时间为3 min时,色谱峰相对峰面积趋于稳定。因此选择解吸时间3 min。

2.3 实验方法评价

2.3.1定性结果

取等量的烘焙前后烟粉样品,充分混合得到质控(QC)样品。采用建立的HS-SPME-GC/MS方法对QC样品进行检测。利用AMDIS对共流出色谱峰进行解析,单次分析检测172个色谱峰。通过与标准品(79种吡啶类、吡嗪类、酸类、酯类、酮类、生物碱、醇类、烷烃)的保留时间和质谱图严格对照,并运用美国国家标准与技术研究院(NIST)标准质谱库进行检索(反匹配度大于800),结合保留指数,初步定性了其中122种挥发性、半挥发性成分(见表3)。检测到的挥发性、半挥发性成分主要是一些香味成分,包括吡啶类、吡嗪类、烯烃类、醛类、酮类、酯类、酸类、醇类、酚类等。

表3 白肋烟中鉴定到的挥发性、半挥发性成分

表3 (续)

Rt: retention time; RI: retention index; R.match: the matching degree of the actual mass spectrum to the standard mass spectrum in National Institute of Standards and Technology.* The compound was identified by comparing the retention time and mass spectrum with standard.The ions in bold were quantitative ions.

2.3.2方法精密度

在化学计量学分析中,目标物分析的精密度影响分析结果。连续5天,每天平行测定3个QC样品,对实验方法的精密度进行了考察。所有检测峰的保留时间的相对偏差均在±0.04 min内,其保留时间的稳定性为自动积分提供了可能。检测到的122种化合物中,93种化合物的相对峰面积的RSD在15%以内,占总峰个数的76%,占总峰面积的95%(见图3)。

2.4 白肋烟烘焙前后挥发性、半挥发性成分的变化

2.4.1PCA分析

为初步了解不同批次烘焙入口与烘焙出口烟叶的相似性和差异性,采用无监督模式的PCA方法对2个批次白肋烟烘焙前后数据进行分析。在图4的PCA得分图中,第2批次烘焙前后白肋烟烟叶样品在第一主成分(PC1)维度上区分明显,PC1代表了样本总体差异的42.6%,第1批次样品烘焙前后差异不明显,但可区分。两批次白肋烟烟叶样品在第二主成分(PC2)维度上区分明显,PC2代表了样本总体差异的27.1%。

图3 不同化合物的日间相对标准偏差的分布

2.4.2PLS-DA分析

图5 烘焙前后白肋烟烟叶的PLS-DA分析

图4 烘焙前(A-1、A-2)、后(B-1、B-2)白肋烟烟叶主成分得分图

为进一步了解白肋烟烟叶烘焙前后挥发性、半挥发性化学成分的差异,将烘焙入口样品作为一组(B-1-1～B-1-6、B-2-1～B-2-6),烘焙出口样品作为一组(A-1-1～A-1-6、A-2-1～A-2-6),建立PLS-DA模型。PLS-DA是一种有监督分析方法,用于建立类别间的数学模型,使各类样品间达到最大的分离,并可根据变量重要性投影(VIP)值筛选差异化合物。图5a的得分图中,烘焙前后白肋烟烟叶在PC1维度上区分明显,PC1代表了样本总体差异的41.1%,且烘焙后的2批次样品在PC2维度上区分明显,PC2代表了样本总体差异的18.6%。建立的PLS-DA模型2个主成分解释了96.1%的Y变量差异,预测能力为94.6%,说明该模型具有较好的预测能力[25]。经过200次排列检验得到的R2、Q2截距分别为0.204和-0.333(见图5b),R2截距小于0.4,Q2截距小于0.05,表明该模型稳定可靠,不存在过拟合。

图6 烘焙前后白肋烟烟叶中挥发性、半挥发性化合物的热图

根据建立的PLS-DA模型的VIP值(阈值为1),初步筛选了32种对区分烘焙前后烟叶贡献大的成分(见图5c)。为更直观地了解白肋烟烘焙前后化学成分的变化,采用32种化学成分对2批次烘焙前后白肋烟烟叶进行聚类分析,并绘制热图(见图6)。结果表明:烟叶样品按照烘焙前和烘焙后明显聚为2大类,烘焙前和烘焙后烟叶又可分别按批次分为2小类,即烘焙前后烟叶可采用差异显著的32种化学成分进行区分。对2个批次烟叶烘焙前后的32种成分分别进行t-检验,除3-乙酰基-1H-吡咯、1,3,7,7-四甲基-2-氧杂双环[4.4.0]-5-葵烯-9-酮在第1批次烘焙前后烟叶间无显著性差异,苯甲酸、乙基香兰素和香兰素在第2批次烘焙前后烟叶间无显著性差异外,其余27种成分在2个批次烟叶样品烘焙前后均存在显著性差异(p<0.05)。烘焙后,2批次白肋烟烟叶中甘油、丙二醇、3-乙基-2-羟基-2-环戊烯-1-酮、2-乙酰基吡啶、三甲基吡嗪、异氟尔酮、茶香酮、薄荷醇、乙基吡嗪、2,5-二甲基吡啶、异戊酸、丁内酯、苯乙醇、2,3-丁二醇、N-甲基-2-吡咯烷酮、2-甲基丁酸、2,3-二甲基吡嗪、γ-己内酯、2-甲基吡啶含量均显著下降;6-乙基-5,6-二氢-2H-吡喃-2-酮、2-吡咯烷酮、吲哚、巴豆酸、3-乙基-4-甲基-1H-吡咯-2,5-二酮、5-羟甲基糠醛、麦芽酚和二烯烟碱含量均显著上升。

与烘焙前相比,烘焙后白肋烟烟叶中的大部分挥发性、半挥发性成分含量下降,主要与挥发有关,此过程也有利于除去2-乙酰基吡啶等不利于烟气感官的物质[26]。另外,烘焙后部分吡咯类、酸类、呋喃类等烟草特征香味成分含量显著上升。吡咯类具有咖啡、可可的香韵,可增加白肋烟烟香;吲哚为色氨酸的分解产物,具有栀子花的香气;巴豆酸含量增高可能与长链脂肪酸的分解和焦糖化反应有关;5-羟甲基糠醛为重要的烟草致香物质,具有甜的花香,与碳水化合物的分解及美拉德反应有关[27,28]。麦芽酚可能为料液中成分,高温烘焙有助于料液的吸收。综上所述,高温烘焙则有助于料液吸收,促进料液与烟叶化学成分发生焦糖化作用和美拉德反应产生香味物质,提高白肋烟烟叶的吸食品质。

3 结论

建立了HS-SPME-GC/MS测定烟叶中挥发性、半挥发性成分的方法。该方法样品用量小、前处理简单、灵敏度高,适用于烟叶中低含量的挥发性、半挥发性成分的测定。同时结合化学计量学方法分析了白肋烟烘焙前后化学成分的变化,为白肋烟烘焙条件的优化提供了科学的检测方法。挥发性、半挥发性成分的非靶向分析方法可较为全面、系统地表征气味物质,与化学计量学结合可直观反映气味物质的变化,筛查关键的风味物质基础,在茶叶、面包等食品加工领域具有广泛的应用推广前景。