昆虫呼肠孤病毒的遗传进化分析

杨杰，徐闻，杨正虎，张晓晓，周吟

（湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北武汉 430068）

呼肠孤病毒（Reoviridae）属于双链RNA病毒，基因组通常具有10～12个节段，可以感染人、禽类、昆虫等，具有15个属。有些动物和植物呼肠孤病毒以昆虫作为传播载体，但其中只能够感染昆虫的呼肠孤病毒包括3个属的病毒：质型多角体病毒属（Cypovirus，简称为CPV）、昆虫非包涵体病毒属（Idnoreovirus）以及迪诺维纳病毒属（Dinovernavirus）[1]。这3种昆虫呼肠孤病毒属的病毒在结构上各有特点，CPV和其他呼肠孤病毒相比，只具有单层的衣壳蛋白，病毒粒子包裹在包涵体蛋白中。昆虫非包涵体病毒属（Idnoreovirus）的病毒和CPV相比，其病毒粒子具有双层衣壳，并且病毒粒子外围不具有多角体蛋白包裹。目前发现的迪诺维纳病毒属（Dinovernavirus）只有两种病毒：Fako virus（FAKV）和Aedes pseudoscutellarisreovirus（APRV）[2-3]，该病毒属的病毒和CPV相同之处在于其病毒粒子也只具有单层衣壳蛋白，所不同的地方在于病毒粒子的外围不具有多角体蛋白。目前对于昆虫呼肠孤病毒的研究主要集中在单株病毒的鉴定上，针对这3种昆虫呼肠孤病毒属在进化上是否具有相关性，目前尚无相关研究，因此本文对其进行了分析。

1 材料与方法

1.1 实验序列的获取

从GenBank（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）下载质型多角体病毒、昆虫非包涵体病毒属和迪诺维纳病毒属的代表病毒的所有序列，并且根据注释信息截取翻译RdRp蛋白和大衣壳蛋白的氨基酸序列片段。RdRp的序列比对使用NCBI的BLAST工具（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行。

1.2 系统发育树的构建

为了进行RdRp和大衣壳蛋白的进化分析，氨基酸序列首先进行ClustalW分析，再使用MEGA5软件根据最大似然法（Maximum-likelihood，ML），自举100次进行进化树的构建。评估测试方法选择Bootstrap，重复次数（Replications）设为100，其他的参数设置为默认值。

2 结果与分析

2.1 昆虫呼肠孤病毒的RdRp进化树分析

依赖RNA的RNA聚合酶（RNA dependent DNA polymerase，RdRp）是所有的RNA病毒在病毒基因组复制过程中必需的酶，因此RdRp被认为是从事病毒进化分析的最佳基因[4]。为了明确昆虫呼肠孤病毒在所有呼肠孤病毒属之间的分类地位，选取刺突呼肠孤病毒亚科（Spinareoviruinae）所有9个属病毒的代表病毒的RdRp氨基酸序列构建进化树，包括质型多角体病毒属（Cypovirus）、昆虫非包涵体病毒属（Idnoreovirus）、迪诺维纳病毒属（Dinovernavirus）、水生呼肠孤病毒属（Aquareovirus）、科罗拉多蜱传热症病毒属（Coltivirus）、斐济病毒属（Fijivirus）、真菌呼肠孤病毒属（Mycoreovirus）、正呼肠孤病毒属（Orthoreovirus）和水稻病毒属（Oryzavirus）。

如图1所示，从系统进化树看，质型多角体病毒属和迪诺维纳病毒属处于同一个分支上，亲缘关系较近，几乎所有不同的呼肠孤病毒属均处于不同的进化分支，另一种昆虫呼肠孤病毒属-昆虫非包涵体病毒属则处于单独的分支上，和CPV等其他昆虫呼肠孤病毒亲缘关系较远。

图1 呼肠孤病毒科刺突呼肠孤病毒亚科病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）系统进化树分析

2.2 昆虫呼肠孤病毒的主要衣壳蛋白进化树分析

由于质型多角体病毒属和迪诺维纳病毒属的RdRp蛋白处于进化树的同一个分支中，为了进一步确定两个病毒属之间的进化关系，使用了主要衣壳蛋白（major capsid protein）的氨基酸序列构建最大似然法进化树。如图2所示，从系统进化树来看，CPV的主要衣壳蛋白分为2个分支，迪诺维纳病毒属的病毒和Dp-CPV1和BmCPV-1处于同一个小分支上，亲缘关系较近，和AmCPV-4等CPV不在同一分支上，亲缘关系较远。

2.3 昆虫呼肠孤病毒编码RdRp的基因组节段末端序列比较

进一步比较了三种昆虫呼肠孤病毒编码RdRp基因组节段的5'和3'末端序列，结果如表1所示，迪诺维纳病毒属的5'末端序列的前4个核苷酸和多种CPV相同，均为AGUU：Choristoneura occidentalis cypovirus 16（CoCPV-16），Inachis io cypovirus 2（IiCPV-2），Orgyia pseudotsugatacypovirus 5（OpCPV-5）；5'末端前3个核苷酸与BmCPV-1、DpCPV-1相同，均为AGU。迪诺维纳病毒属的5'末端氨基酸序列与CPV有较大相似性。

图2 质型多角体病毒和迪诺维纳病毒主要衣壳蛋白的系统进化树分析

表1 部分昆虫呼肠孤病毒编码RdRp基因组节段5'和3'末端序列的特性比较

3 结论

本研究对昆虫呼肠孤病毒科的CPV、昆虫非包涵体病毒、迪诺维纳病毒的RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）和主要衣壳蛋白（major capsid protein）这两个基因的进化树以及5'末端序列的分析，结果显示CPV和迪诺维纳病毒有较近的亲缘关系。迪诺维纳病毒属的FAKV和APRV都是从蚊子的细胞系中分离得到的，而有一部分CPV也是从蚊子中分离得到的，例如Anopheles cypovirus、Uranotaenia sapphirinacypovirus 17（UsCPV-17）和Culex restuanscypovirus 17（CrCPV-17）[5-7]。除了在遗传上和宿主上迪诺维纳病毒属和CPV具有相似性以外，它们的病毒粒子的结构也非常类似[2-3]。迪诺维纳病毒属具有9个双链RNA基因组节段，和其他属的CPV相比，只是缺少编码多角体蛋白的基因组节段。推测对于迪诺维纳病毒属来说，因为只是在昆虫细胞中增殖，并不需要在昆虫里面增殖，所以编码多角体的基因组节段，对于迪诺维纳病毒属来说并不是必需的，因此认为迪诺维纳病毒属被分为CPV外的另一个属可能不恰当，它可能应该被认定为CPV中的亚属才更为恰当。