重组大肠杆菌产人成纤维细胞生长因子8a工业化发酵工艺优化

2019-11-07 11:03王莉洁孙丹罗春艳
生物化工 2019年5期
关键词:卡那霉素菌体纤维细胞

王莉洁,孙丹,罗春艳

(1.辽宁何氏医学院健康营养学院,辽宁沈阳 110163;2.沈阳眼产业技术研究院有限公司,辽宁沈阳 110163)

人成纤维细胞生长因子家族(Human Fibroblast growth factors,hFGFs)是一群具有多种生理功能的生长因子,FGF8(fibroblast growth factor 8)是1992年由Tanaka等[1]在雄性激素依赖性小鼠乳腺癌SC-3细胞系中分离出来的,其在胚胎发育、血管生成和伤口愈合上,对组织和细胞的增殖和分化起着重要作用,是胚胎发育中不可缺少的生长因子之一。hFGF8a由233个氨基酸组成,具有4种亚型:FGF8a、FGF8b、FGF8e和FGF8f[2-4]。近年来,生物制药技术发展迅猛,引起了国内生物制药公司的广泛关注,生物发酵方法有助于实现制药工艺的标准化、产业化、规模化的发展。基因工程制药的快速发展也开发了一系列针对疑难杂症的药物,通过生物发酵技术开拓了药物生产来源的供给途径。目前,FGF具有广泛的生物学活性和重要的临床应用价值,然而,重组人成纤维细胞生长因子8a(recombinant human fibroblast growth factor 8a,rhFGF8a)作为一种新型的治疗手段,其生产成本和生物发酵生产的稳定性等核心问题有待解决,本文以产rhFGF8a多肽的重组大肠埃希菌[5]为研究对象,考察两种发酵培养基对其工业发酵生产的稳定性、表达量和产量的影响,为该重组大肠埃希菌在规模化生产中提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验菌种

重组基因工程菌大肠杆菌BL21(Escherichia coli),菌体中含有FGF8a基因,基因来源于人成纤维细胞中,由华侨大学林俊生教授馈赠。

1.2 主要试剂

大豆胨、胰化蛋白胨、酵母提取物,购自OXIOID公司;氯化钠、磷酸氢二钾、葡萄糖购自国药试剂公司;卡那霉素、异丙基β-D-硫代半乳糖苷(简称IPTG),购自Inalco公司;纯化试剂,购自北京康为世纪公司。

1.3 主要仪器

生物净化工作台,苏州净化有限公司生产;全温振荡培养摇床、恒温培养箱,上海一恒仪器有限公司生产;蛋白电泳仪,美国伯乐公司生产;脱色震荡摇床,北京六一仪器有限公司生产;低温冷冻离心机,美国艾本德公司生产;细胞超声破碎仪,宁波新芝仪器公司生产;磁力搅拌发酵罐(50 L),上海保兴仪器公司。生产

1.4 主要溶液与培养基

液体培养基1:称取大豆胨90 g、氯化钠150 g、磷酸氢二钾75 g、葡萄糖75 g、胰化蛋白胨510 g,加入30 L H2O,待灭菌后冷却为40 ℃时加入卡那霉素50 mg/mL储液(终浓度为50 μg/mL),倒入发酵罐中121 ℃灭菌30 min,灭菌后降至37 ℃备用。调节pH 7.2。

液体培养基2:称取氯化钠300 g、酵母提取物150 g、胰化蛋白胨300 g,加入30 L H2O,待灭菌后冷却为50 ℃时加入卡那霉素50 mg/mL(终浓度为50 μg/mL),倒入发酵罐中121 ℃灭菌30 min,灭菌后降至37 ℃备用。调节pH 7.2。

卡那霉素(50 mg/mL)储液:称取50 g卡那霉素加入1 L H2O溶解,用0.22 μm滤膜,过滤灭菌后的补料瓶中保存备用。

IPTG(1 mmol/L)储液:称取240 g IPTG粉末加入1 L H2O溶解,用0.22 μm滤膜,过滤灭菌后的补料瓶中避光保存备用。

1.5 试验方法

1.5.1 菌种活化

取低温保藏的甘油菌株50 μL接种到50 mL LB液体培养基中,37 ℃、180 r/min过夜活化。

1.5.2 不同培养基的发酵人FGF8a重组大肠杆菌种子液生长曲线

分别选择1.4中液体培养基1与液体培养基2各250 mL,加入卡那霉素(Kanamycin,Kan)100 mg/mL,接入活化后的重组菌液250 μL,200 r/min、37 ℃恒温振荡培养,分别测定其生长情况。

1.5.3 不同培养基中人FGF8a的重组大肠杆菌中发酵诱导表达与产量测定

分别取上述不同培养液的重组人FGF8a工程菌种子液,按照1∶50比例分别接入30 L的液体培养基1(含卡那霉素)与液体培养基2(含卡那霉素)中培养,转速200 r/min,通气量20%,采用1 mol/L NaOH与0.5 mol/L HCl全程自动控制pH,当菌体OD600=0.8时,加入终浓度1 mmol/L的IPTG,28 ℃诱导16 h,结束发酵后,5 000 r/min 4 ℃离心15 min,收集菌体,加入细菌裂解液,采用超声破碎仪进行破碎后,进行SDS-PAGE电泳检测,观察菌体总蛋白与目的蛋白表达量情况,测定其hFGF8a产量。同时,取未加IPTG的菌液作为对照组。

1.5.4 重组菌中人成纤维细胞生长因子8a的Western blot鉴定

取相同浓度下液体培养基1与液体培养基2发酵培养后提取的总蛋白溶液,经SDS-PAGE电泳后转移到PVDF膜上,进行电转,5%脱脂奶粉封闭30 min,在鼠抗6×HIS抗体中4 ℃孵育过夜。次日膜进行TTBS清洗,在羊抗小鼠IgG-HRP的二抗中孵育1 h,通过ECL发光试剂盒显影曝光,鉴定hFGF8a,并定量其表达量,膜采用丽春红进行染色。

2 结果与分析

2.1 不同种子液培养基培养人FGF8a重组菌的生长测定

在培养种子过程中,液体培养基1与液体培养基2中种子菌株均从延滞期开始复苏,随后在2 h后进入指数生长期,在16 h后进入平缓期,如图1所示。因此,选取16 h后进行诱导表达,此时细胞活力和质粒稳定性较强,可缩短发酵周期,降低成本。

图1 不同种子液培养基人FGF8a重组菌生长曲线

由图1可知,液体1号培养基与液体2号培养基在菌株活化与种子液培养上,生长趋势与时间并无较大差距。16 h后菌体活力比较液体2号存在下降趋势,两种培养基均可以用于菌株活化与种子液培养。

2.2 人成纤维细胞生长因子8a的重组菌的表达

通过液体1号培养基与液体2号培养基发酵培养的重组菌,用1 mmol/L IPTG进行诱导表达,16 h后提取菌体总蛋白,进行SDS-PAGE电泳分析,两种培养基在预期分子量大小位置均出现明显的蛋白条带(图2),且液体2号培养基发酵培养后的重组菌在诱导后rhFGF8a蛋白的表达明显。

图2 不同培养基发酵下人FGF8a重组菌的SDS-PAGE分析

2.3 人成纤维细胞生长因子8a的重组菌的Western blot鉴定

经过BSA方法蛋白含量测定后,调整不同培养基发酵诱导后的菌体总蛋白含量,使其保持一致后,经Western blot鉴定该蛋白条带为rhFGF8a(图3)。由图3可知,液体2号培养基在发酵过程中重组人FGF8a的表达量高于液体1号培养基,因此,选择液体2号培养基为发酵培养基。通过表达量计算得出液体2号培养基获得的重组人FGF8a产量在80 mg/L。

图3 Western blot鉴定重组菌中人FGF8a表达

3 讨论

我国生物技术起步较晚,经过近三十年的迅速发展,生物技术基础研究综合实力都有了很大的提升,但同发达国家相比差距非常明显。生物技术成果转化率低,中试能力及产业化技术水平落后,生物技术成果大多仅限于基础研究,停留在实验室研究水平,不能满足企业生产和商品化的需要,这都是制约我国生物技术发展的重要因素。随着人成纤维生长因子家族的功能多样化越来越受到更多科研人员甚至生物公司的关注,但在以往的研究中开发的都普遍停留在实验室摇瓶阶段,大规模发酵生产的国内公司很少,建立一套简单有效的生产工艺,有利于该因子的产业化进程推进。本实验筛选得到了50 L规模中试发酵生产的最优培养基,建立了一种重组人FGF8a的表达生产工艺方案,此外,这种成分简单、操作容易、成本低廉的发酵培养基,为后续的研发进程奠定了基础。但后续对于工业化生产下游产品纯化与活性鉴定还需要其他学者进一步研究与探讨。

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