临床金黄色葡萄球菌对消毒剂耐药性研究

张艳娇，刘海锋，廖小微，李柏舟，孙丰慧，代敏，郭莉娟＊

（1.成都医学院 检验医学院，四川成都 610500；2.成都医学院四川省动物源性兽药残留防控工程实验室，四川成都 610500）

金黄色葡萄球菌是一种常见致病菌，也是导致院内感染的最主要的一种病原体，是化脓性感染的重要病原菌，其主要致病毒素为肠毒素、PVL杀白细胞毒素、中毒性休克毒素-1等[1]。金黄色葡萄球菌可导致创面伤口、皮肤软组织以及血液等感染[2]，极大地危害人体健康。本实验对从医院取样并分离纯化的金黄色葡萄球菌进行对十六烷基三甲基溴化铵、苯扎氯铵、十二烷基二甲基苄基溴化铵、双十烷基二甲基氯化铵和氯代十六烷基吡啶这5种常用季铵盐消毒剂的最低消毒剂抑菌浓度（MIC）测定，为医院合理使用消毒剂提供有力依据。

1 材料及方法

1.1 菌株来源

样品为从医院采集，并经分离鉴定的金黄色葡萄球菌共107株，实验室保存。质控菌株为ATCC10536。

1.2 试剂

培养基：营养琼脂培养基（NA），由北京陆桥技术有限责任公司生产；水解酪蛋白琼脂培养基（MHA），由OXOID公司生产。

消毒剂：十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrimethy Ammonium Bromide，CTAB），苯扎氯铵（Benzalkonium chloride，BC）98%，十二烷基二甲基苄基溴化铵（Dodecy Dimethyl Benzyl Ammonium Bromide，DDBAB）氯代十六烷基吡啶（Cetylpyridinium Chloride Monohydrate，CTPC），双十烷基二甲基氯化铵（Didecyl Dimethyl Ammonium Chloride，DDAC）99%，以上消毒剂均为成都市科龙化工试剂厂产品。

1.3 消毒剂最低抑菌浓度（MIC）测定[3]

1.3.1 菌悬液制备

将金黄色葡萄球菌增菌平板从恒温培养箱中取出，用无菌棉签蘸取3～5个单菌落加入3mL无菌生理盐水中，充分混匀，制备菌悬液，菌悬液浊度相当于0.5麦氏比浊。取充分混匀后的菌悬液200μL加入1.8mL生理盐水中，稀释完成，并于分光光度计在625nm处检查吸光度在0.08～0.10，菌液再稀释10倍。

1.3.2 制备消毒剂平板

采用二倍稀释法将消毒剂稀释为10240mg/L、5120mg/L、2560mg/L、1280mg/L、640mg/L、320mg/L、160mg/L、80mg/L、40mg/L、20mg/L、10mg/L、5mg/L和2.5mg/L。每个平皿加2mL消毒剂以及18mL MHA培养基并将其充分混匀，冷却凝固即可得到分别含有不同浓度消毒剂的MHA培养基平板（终浓度为0.25mg/L、0.5mg/L、1mg/L依次递增到1024mg/L），每个浓度做3个平行组。

1.3.3 接种培养

吸取按照上述操作制备的金黄色葡萄球菌菌液1mL，用多点接种仪从毒剂低浓度平皿依次至高浓度进行接种。接种完成后，将平板正向静置10 min后置于恒温培养箱中，37℃培养18～24h。

1.3.4 结果观察与记录

培养完成后，取出MHA平板并放置于暗色且无反光的桌面上，仔细观察消毒剂平板上各金黄色葡萄球菌菌斑的生长情况，以刚好完全不见某金黄色葡萄球菌样品生长的MHA平板所对应的消毒剂最低浓度为试验终点，即该金黄色葡萄球菌样品的消毒剂最低抑菌浓度。详细记录各消毒剂浓度平皿上接种的金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度，以供实验进行统计。

2 结果与分析

2.1 消毒剂MIC值测定结果

107株金黄色葡萄球菌在不同消毒剂浓度下的菌株分布情况见表1。由表1可知，107株金黄色葡萄球菌对BC的MIC值为0.5～256mg/L。其中，对BC的MIC值为1mg/L的菌株有22株（20.56%），MIC值为2mg/L的菌株有16株（14.95%），MIC值为4mg/L的菌株有13株（12.15%），MIC值为8mg/L的菌株有19株（7.48%），MIC值为128mg/L的菌株有21株（19.63%）。

表1 107株金黄色葡萄球菌在不同消毒剂浓度下的菌株分布情况

107株金黄色葡萄球菌对DDBAB的MIC范围为0.5～256mg/L：MIC值为2mg/L的菌株有24株（22.43%），MIC值为4mg/L的菌株有25株（23.36%），MIC值为64mg/L的菌株有22（20.56%）株，MIC值为256mg/L的菌株有11株（10.28%）。

107株金黄色葡萄球菌对DDAC的MIC值与以上两种相近，为0.25～256mg/L，其中：MIC值为0.5mg/L的菌株有20株（18.69%），MIC值为2mg/L、4 mg/L的菌株均有16株（14.95%），MIC值为32mg/L的菌株有24株（22.43%）。

107株金黄色葡萄球菌对CTAB的MIC值为2～1024mg/L，其中：MIC值为2mg/L的菌株有12株（11.21%），MIC值为4mg/L的菌株有27株（25.23%），MIC值为8mg/L的菌株有24株（22.43%），MIC值为512mg/L的菌株有12株（11.21%）。

107株金黄色葡萄球菌对CTPC的MIC值为1～1024mg/L，其中：MIC值为2mg/L的菌株有45株（42.06%），MIC值为4mg/L的菌株有23株（21.5%），MIC值为512mg/L的菌株有13株（12.15%）。

2.2 金黄色葡萄球菌对季铵盐类消毒剂的MIC90和MIC50

107株临床金黄色葡萄球菌对CTAB、BC的MIC50都为8 mg/L，对DDBAB、CTPC、DDAC的MIC50都为4mg/L；对CTAB的MIC90为512mg/L、BC的MIC90为128mg/L、DDBAB的MIC90为256mg/L、DDAC的MIC90为64mg/L这三种消毒剂的MIC90均为256mg/L，CTPC的MIC90可达1024mg/L。从MIC90来比较，CTPC＞CTAB＞DDBAB＞BC＞DDAC。由此可见，DDAC的消毒剂效果最好。

3 讨论

金黄色葡萄球菌在临床标本中的分离率呈逐年递增的趋势[4]，已成为医院感染的重要致病菌之一。鹿桂乾等[5]研究认为，季铵盐消毒剂的取代烷基为十二烷基和十六烷基时对金黄色葡萄球菌的杀灭效果较好，而当消毒剂为带短烷基链的季铵盐消毒剂时，其对金黄色葡萄球菌的杀灭能力较弱。也有学者发现，部分金黄色葡萄球菌对苯扎溴铵（BC）产生了一定抗性[6]。高文凤等[7]采用悬液定量杀菌试验法，测得BC在浓度为200mg/L时即可对金黄色葡萄球菌产生较好的灭菌效果；而李春梅等[8]则测得BC在浓度为1000mg/L时可对金黄色葡萄球菌产生较好的灭菌效果。

季铵盐类消毒剂使用历史已十分长久，其性能温和，对人体皮肤黏膜无刺激性[9]，且毒性低、对被消毒物品无损害[10]，但其属于一类低效消毒剂。近年来，复合季铵盐消毒剂发展较快，但实际功效仍待考虑。张利平等[11]认为，复合季铵盐消毒剂对金黄色葡萄球菌具有较强的杀灭作用，而李长青等[12]认为复合季铵盐类消毒剂虽性能稳定，腐蚀性较低，但仍属于低效消毒剂，在消毒实践中应该合理地选择和使用。在医院、单位等进行消毒时，应注意消毒剂的使用量，按照正确用量使用，切勿滥用消毒剂导致细菌产生抗性或用量过低导致灭菌不完全而导致的耐药性增强，同时应避免消毒剂残留时间过长导致细菌耐药性增强。除此之外，应定期更换使用的消毒剂种类，避免细菌长期频繁接触同种消毒剂导致对消毒剂产生耐药性。