乳蛋白中可利用赖氨酸及其封闭产物含量的测定

陈磊，田芳，毛颖异，蔡小堃，杨颖，庄柯瑾，冯晓涵，赵艳荣，张微

（1.雅培营养品上海研发中心，上海200233；2.东北农业大学食品学院乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨

150030）

0 引言

配方乳粉的基质大部分由乳蛋白构成，而乳蛋白的形式多种多样，如全脂液乳，脱脂液乳，乳粉等。这些乳制品均是新鲜牛乳通过不同热处理工艺加工而成。这些工艺以及存储的时间导致生产的乳制品中各营养成分降低与降解产物增加，即新鲜度的降低[1]。同时，这些工艺会不同程度地影响乳制品中美拉德反应的进行，导致氨基酸等小分子营养物质的损失以及美拉德反应产物含量的升高。因此，评估乳品中可利用氨基酸及其美拉德反应产物的水平对于评价乳制品的新鲜度具有重要意义。

美拉德反应是氨基酸和还原糖之间发生的一系列复杂反应[2-3]。美拉德反应会造成氨基酸（赖氨酸、精氨酸、蛋氨酸等）利用率的降低及不可消化利用的氨基酸封闭产物（呋喃素，羧甲基赖氨酸（CM L）等）的生成[4-5]。美拉德反应主要分为三个阶段：初级、高级和终级阶段。初级阶段主要生成Am adori重排产物，高级阶段主要生成糖基化最终产物，终级阶段则会聚合产生类黑精大分子[6-7]。呋喃素是Am adori重排化合物的降解产物[8]，常被作为检测美拉德反应初级阶段的指针化合物[9]。而CM L是美拉德反应高级阶段的主要产物之一，在该阶段更能代表蛋白的破坏程度[10]。美拉德反应终级阶段产物一般不会在乳品中出现，因此这里没有对该阶段进行评估。蛋白质中氨基酸组分会随着美拉德反应的进行逐渐损失，可利用赖氨酸由于在乳蛋白产品中含量较高，并且与还原糖类反应活性较强，常被用作评价牛乳制品新鲜程度及营养损失的指标[11-12]。所以，同时检测可利用赖氨酸，呋喃素及CM L的含量能够更准确的评估乳制品的新鲜度。对于乳及乳制品中呋喃素的检测，反相高效液相色谱紫外检测（RP-HPLC-UV）方法为最常见的方法之一[13-15]。Kulm yrzaev等也使用表面荧光光谱法对牛奶中的呋喃素的含量进行快速无损检测[16]。乳及乳制品中CM L的检测国外研究也多见报道[7,10,17-18]，分析方法包括酶联免疫法（ELISA）、HPLC、气相色谱法（GC）、气相色谱质谱联用（GC-M S）及液相色谱质谱联用（LC-M S/M S）等。对于乳及乳制品中可利用赖氨酸含量的监测，使用邻苯二甲醛（OPA）或氯甲酸芴甲酯（FMOC）衍生后进行HPLC分析是常用的分析检测方法[19]。同时检测CM L及可利用赖氨酸含量的方法国内外还未见报道。

本研究的目的是建立一套全面系统的评价乳制品中可利用赖氨酸保留程度与美拉德反应水平的方法。使用RP-HPLC-UV建立了美拉德反应早期产物呋喃素的检测方法；使用FMOC衍生后经反相高效液相色谱荧光检测（RP-HPLC-FLD）建立同时检测美拉德反应高级产物CM L及可利用赖氨酸含量的方法。

1 材料与方法

1.1 样品

巴氏杀菌全脂牛奶（3.4%蛋白，5.2%乳糖）、巴氏杀菌脱脂牛奶（3.4%蛋白，5.2%乳糖）、超高温瞬时灭菌（UHT）全脂牛奶（3.2%蛋白，4.7%乳糖）、超高温瞬时灭菌（UHT）脱脂牛奶（3.6%蛋白，5.1%乳糖）为市售产品；低热脱脂乳粉（LH-SM P，34%蛋白，52%乳糖）、中热脱脂乳粉（MH-SM P，34%蛋白，52%乳糖）购自蛋白原料供应商。

1.2 试剂耗材与仪器

浓盐酸（37%）、柠檬酸钠、磷酸二氢钾、磷酸、硼酸钠、硼氢化钠及柠檬酸钠均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；50 w t%NaOH溶液及FMOC购于Sigm a-Aldrich；戊烷、乙酸乙酯、异丙醇及乙腈均为色谱纯，购于赛默飞世尔科技公司；L-赖氨酸标准品购于上海安谱科学仪器有限公司；呋喃素盐酸盐标准品购于IR ISBIOTECH GmbH（Marktredwitz,Germ any）；CM L标准品购于TRC Canada(Toronto,Canada)。

1260 HPLC高效液相色谱仪，配置紫外可见及荧光检测器，美国安捷伦科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 呋喃素的分析测定

准确称取2 g左右（精确至0.0001 g）乳粉样品于烧杯中，加水至约25 g，充分混匀。准确称取2 g左右（精确至0.0001 g）复溶乳粉样品（液态乳样品直接称取2 g左右）于55 m LPTFE微波消解管中，加入8 m L盐酸溶液（6 N），涡旋混匀后，充氮5 m in后立刻旋紧盖子，于110℃烘箱中加热20 h。取出冷却至室温后，混匀。量取2 m L于15 m L离心管中，加入5 m L柠檬酸钠溶液（0.7 M），混匀后经0.45μm尼龙滤膜过滤进行HPLC分析。使用呋喃素盐酸盐为标准品绘制标准曲线，外标法定量。使用安捷伦1260 HPLC配置紫外可见检测器进行分析。色谱柱为YMC-Pack ODS-AQ(250 mm×4.6 mm I.D.,5μm)，柱温20℃,进样量5μL，检测波长为280 nm。流动相A为0.02 m o l/L磷酸二氢钾磷酸缓冲液，p H 2.9；流动相B为磷酸二氢钾磷酸缓冲液（0.02 m ol/L,pH 2.9）∶异丙醇∶乙腈=26∶7∶7。梯度洗脱程序见表1。

表1 HPLC分析呋喃素梯度洗脱程序

1.3.2 CM L和赖氨酸的测定

准确称取0.2 g左右（精确至0.0001 g）乳粉样品或0.5 g左右（精确至0.0001 g）液态乳于50 m L PTFE微波消解管中，加入3.5 m L硼酸钠缓冲液（0.2 mol/L,p H 9.5），混匀，再加入2 m L硼氢化钠溶液（1 m o l/L溶于0.1 mol/L NaOH），室温下静置反应4 h。反应结束后，加入10 m L浓盐酸（37%）及5 m L水，涡旋混匀。充氮5 m in后立刻旋紧盖子，于110℃烘箱中加热20 h。取出冷却至室温后，使用50 w t%NaOH溶液调p H至8-9之间，加水至30 m L，样液经0.45μm尼龙滤膜过滤后以进行下述衍生反应。测定赖氨酸时，消解液需根据样品中氨基酸的含量进行适应倍数的稀释以确保赖氨酸的衍生完全。加入250μL硼酸钠缓冲液（0.2 m ol/L，p H 9.5）于玻璃试管中，再加入50μL上述经过滤的样品溶液（或CM L及赖氨酸标准溶液），涡旋混匀。加入250μL FMOC衍生试剂溶液（10 mg/m L溶于乙腈中，现用现配），涡旋混匀后，于室温下静置反应10 m in。反应液经0.45μm尼龙滤膜过滤于进样小瓶中，加入500μL戊烷/乙酸乙酯（v戊烷∶v乙酸乙酯=9∶1），涡旋2次，每次10 s，以将过量的FMOC衍生试剂萃取至上层有机相，下层水相则含有经衍生的CM L和赖氨酸。此进样小瓶直接进行HPLC分析。CM L及赖氨酸标准溶液经过与样品相同的衍生步骤，进行HPLC分析并绘制标准曲线。使用安捷伦1260 HPLC配置荧光检测器进行分析。色谱柱为Zorbax SB C 18(250 mm×4.6 mm I.D.,5μm)，柱温20℃,进样量5μL，激发波长为262 nm，发射波长为310 nm。流动相A为0.05 m o l/L柠檬酸钠缓冲液（pH 3.0）∶乙腈=825∶175；流动相B为水∶乙腈=1∶4。梯度洗脱程序见表2。

表2 HPLC分析CML及赖氨酸梯度洗脱程序 m o l/L

1.3.3 统计学分析

采用SPSS 22.0进行数据处理与分析。采用独立样本T检验来评估两个样本间数据差异的显著性，采用单因素ANOVA评估多个样本间数据差异的显著性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 方法验证

2.1.1 呋喃素分析方法的验证

本研究对呋喃素分析方法的线性、准确性、精密度及回收率进行了全面的验证。验证结果显示本方法在呋喃素含量0.840μg/m L～8.16μg/m L的分析范围内线性良好（r＞0.999）。选用实验室内部乳粉质控样品为基质，3天6次测定结果的平均值为43.6 m g/100g。选用此本底值的50%、100%、及200%3个不同的呋喃素浓度水平进行加标回收试验，以验证此方法的准确性、回收率及精密度，验证结果见表3。3个不同浓度水平的加标回收率均在90%～110%之间，RSD%均小于5%，显示此方法具有良好的准确性、回收率及精密度。

表3 呋喃素分析方法的准确性、回收率及精密度的验证结果

2.1.2 CM L及赖氨酸分析方法优化及验证

2.1.2.1 同时检测CM L及赖氨酸方法的优化

为提高检测效率，本研究在D rusch及吕莹果等[10,19]报道的方法基础上进行改进，以同时检测CM L及赖氨酸。Dunn等[20]发现蛋白酸水解过程中，美拉德反应早期产物果糖赖氨酸等可以进一步生成高级产物CM L，致使检测结果偏高。本实验中，将样品在酸水解前经硼氢化钠将果糖赖氨酸等还原为糖醇赖氨酸，以抑制其在之后的酸水解过程向CM L的转化，进而确保CM L的测定值更接近真实值。OPA及FMOC是比较常用的两种氨基衍生试剂。OPA不能与二级氨基反应，且衍生产物不稳定，需衍生后立即进行样品分析，故本研究选用FMOC做为CM L和赖氨酸的衍生试剂。FMOC能同时与一级及二级氨基反应，所得衍生产物较OPA稳定，但其试剂本身及水解产物有荧光，会对之后的色谱分离产生严重干扰。为消除此干扰，衍生后的样品溶液使用戊烷/乙酸乙酯（v戊烷∶v乙酸乙酯=9∶1）进行萃取，将多余的FMOC衍生试剂萃取至上层戊烷层。将含CM L及赖氨酸FMOC衍生产物的下层水相进行HPLC分析，可以得到背景清晰的图谱。

2.1.2.2 分析方法的验证

本研究对方法分析CM L的线性、准确性、精密度及回收率进行了全面的验证。验证结果显示本方法在CM L含量0.0415～2.85μg/m L的分析范围内线性良好（r＞0.999）。选用实验室内部乳粉质控样品为基质，3天6次测定结果的平均值为8.03 m g/100g。选用此本底值的30%及60%两个不同CM L浓度水平进行加标回收试验，以验证此方法的准确性、回收率、及精密度，验证结果见表4。两个不同浓度水平的加标回收率均在90%～110%之间，RSD%均小于5%，显示此方法具有良好的准确性、回收率及精密度。

表4 方法分析CML的准确性、回收率及精密度的验证结果

本研究对方法分析赖氨酸的线性、准确性、精密度及回收率进行了全面的验证。验证结果显示本方法在赖氨酸含量0.214μg/m L～19.2μg/m L的分析范围内线性良好（r＞0.999）。选用实验室内部乳粉质控样品为基质，3天6次测定结果的平均值为774 m g/100g。选用此本底值的30%及60%两个不同的赖氨酸浓度水平进行加标回收试验，以验证此方法的准确性、回收率及精密度，验证结果见表5。两个不同浓度水平的加标回收率均在90%～110%之间，RSD%均小于5%，显示此方法具有良好的准确性、回收率及精密度。

表5 方法分析赖氨酸的准确性、回收率及精密度的验证结果

2.2 乳制品的测定与分析

采用所建的方法测试巴氏杀菌全脂牛奶、巴氏杀菌脱脂牛奶、UHT全脂牛奶、UHT脱脂牛奶、LH-SM P、M H-SM P这6种乳制品中呋喃素，CM L及可利用赖氨酸的含量。对各个乳制品之间呋喃素，CM L与可利用赖氨酸的含量做了单因素ANOVA多重比较分析发现液态牛奶与乳粉中的各分析物均存在显著的差异（见表6），4种液态牛奶中可利用赖氨酸含量均显著高于两种脱脂乳粉（P＜0.01），而呋喃素与CM L含量则显著低于脱脂乳粉（P＜0.01）；巴氏杀菌牛奶中呋喃素含量低于UHT牛奶（P＜0.01），可利用赖氨酸与CM L含量无明显差别（P＞0.05）。两个样本间采用独立样本T检验进一步进行评估，巴氏杀菌全脂牛奶与脱脂牛奶中可利用赖氨酸，呋喃素与CM L含量均无明显差别（P＞0.05）；UHT脱脂牛奶中呋喃素含量比UHT全脂牛奶高（P＜0.01），可利用赖氨酸与CM L含量无明显差别（P＞0.05）；LH-SM P中可利用赖氨酸含量高于MH-SM P（P＜0.05），呋喃素含量低于MH-SM P（P＜0.01），CM L含量无明显差别（P＞0.05）。

表6 乳制品中呋喃素，CML及可利用赖氨酸的含量

新鲜牛乳中含有大量的蛋白与还原糖（主要为乳糖），加热过程中易发生美拉德反应，且美拉德反应的程度随着热处理温度的升高而加剧[21]。同时，乳粉的生产往往会经过加热浓缩，喷雾干燥等高温工艺，从而导致美拉德反应程度的剧烈增加，对于牛乳的新鲜度和营养价值造成不利的影响。另外，乳粉原料的货架期通常为两年，液态牛奶原料通常在一个月内，而美拉德反应与存储条件及存储时间密切相关，较高的温度与湿度，较长的储存时间均会导致可利用氨基酸的损失，并产生较多的美拉德反应产物[22]。因此对于乳粉原料，为期两年的储存条件的控制尤为重要，恰当的存储条件才能有效避免可利用氨基酸的损失及大量氨基酸封闭产物的生成。研究发现，呋喃素、CM L等赖氨酸封闭产物会导致许多健康问题[3]，而生产过程中不可避免地会产生的少量呋喃素与CM L，但是由于其含量很低，我国国家标准中并没有给出它们的限量要求，而欧洲儿科胃肠病学和营养学会则强烈建议尽可能控制赖氨酸封闭产物的产生[23]。所以优质的原料应含有较高可利用赖氨酸，同时含有较少的呋喃素与CM L。表6的数据指出相比于乳粉，巴氏杀菌全脂和脱脂液态鲜奶能够锁留更多可利用赖氨酸和保留更多蛋白质的天然营养价值，具有更高的新鲜度。巴氏杀菌与UHT灭菌处理方式相比，其受热时间虽然较长，但是巴氏杀菌处理的温度低于UHT灭菌处理，因此巴氏杀菌处理方式有利于减少美拉德反应初级阶段的发生，导致产生较少的呋喃素，另外由于两种处理方式温度与时间都有良好的控制，不影响美拉德反应高级阶段的发生，并都有效锁留了可利用氨基酸。同理，相比中热处理的脱脂乳粉，低热处理的脱脂乳粉中可利用赖氨酸含量损失较少，呋喃素含量也较低。另外，同种杀菌方式的全脂牛奶与脱脂牛奶中可利用赖氨酸无明显差别说明脂肪不影响乳蛋白体系中可利用赖氨酸的损失，但是UHT脱脂牛奶相比UHT全脂牛奶含有更高的蛋白与乳糖，这导致其生产加工过程中产生较多的呋喃素。

3 结论

建立了高效准确测定乳制品中可利用赖氨酸，呋喃素以及CM L的检测方法，并采用所建检测方法评估了6种市面常见的乳制品及乳蛋白原料。实验发现液态奶由于比乳粉具有较少的工艺环节，较低温度及较短时间的工艺参数，能够更为有效锁留其中的可利用赖氨酸，并控制美拉德反应的进行，是一种用于生产配方乳粉的更为优质新鲜的原料。不同生产工艺的液态奶中，巴氏杀菌液态奶由于其较低的杀菌处理温度，其氨基酸封闭产物的产生较UHT液态奶更少。另外，尽管生产乳粉过程中会有部分可利用赖氨酸的损失，但采用较低的工艺温度可以有效控制损失的程度，并减少美拉德反应的进行。同时，在投入生产之前需要控制乳粉储存条件（温度，湿度，等）与储存时间，以保证其新鲜度。本研究可以为乳制品的新鲜度研究提供高效准确的方法，并对乳制品原料的选择及储存提供指导。