硝态氮处理对雪菊幼苗生长及代谢的影响

秦亚楠，杨增强，赵志信，邓霜霜，褚佳瑶，李志慧，买尔丹·买买提，秦 勇

(1.新疆农业大学林学与园艺学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆农业规划研究院，乌鲁木齐 830002)

0 引 言

【研究意义】雪菊，学名为两色金鸡菊(CoreopsistinctoriaNutt.)，又名昆仑雪菊、天山雪菊等，属菊科金鸡菊属一年生草本植物[1]。雪菊是具有独特功效的植物，我国野生雪菊主要生长于海拔3 000多m的昆仑山一带，人工栽培主要在昆仑山北侧的新疆和田地区。长期以来，雪菊被当地居民当花茶饮用，是一种具有广阔前景和研究价值的药用植物[2-3]。雪菊的主要代谢产物有多糖、蛋白质、有机酸、黄酮类物质等[4]，其药理作用可能是多种代谢产物综合作用的结果。氮素作为植物最重要的营养元素之一，对植物生长发育以及代谢起重要作用。研究表明,氮素可以影响植物类黄酮物质的合成[5]，并以多种方式参与植物体内各种代谢过程，对增进作物生长发育及品质有着明显作用[6]。【前人研究进展】Kovacik和Klejdus[7]对洋甘菊的研究发现，施用铵态氮可以显著促进洋甘菊绿原酸的积累，增强酚酸物质代谢。李志元等[8]研究表明，不施和少施铵态氮有利于雪菊的可溶性糖、总黄酮以及绿原酸的积累。张朋等[9-10]研究表明，增加施用硝态氮比例有利于提高杭白菊的根、茎、叶及花中总黄酮和绿原酸的含量。刘伟等[11]研究发现，全生育期缺氮比生殖期缺氮更有利于菊花根、叶及花中黄酮类化合物的积累。【本研究切入点】氮对植物生长代谢的影响不仅与氮素形态、植物种类有关，在植物不同生育期的影响也不尽相同。目前，硝态氮对雪菊幼苗生长及代谢影响的研究未见报道。研究硝态氮对雪菊幼苗生长及代谢产物的影响。【拟解决的关键问题】筛选出适宜雪菊幼苗生长的硝态氮肥施用量，为建立雪菊更加合理的施肥体系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验于2019年3～5月在新疆农业大学植物工厂工程技术研究中心的室内外进行，测定项目在新疆农业大学林学与园艺学院实验室进行。

供试种子采自新疆和田地区皮山县克里阳乡，选取籽粒饱满、大小一致的雪菊种子作为播种材料。

供试肥料为硝酸钙、过磷酸钙、硫酸钾(天津市致远化学试剂有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 盆栽试验设计

试验采用随机区组设计，设置6个处理，每个处理15盆，重复3次，共计270盆。

当幼苗在穴盘中长至4～6片叶时，定植，定制盆为聚乙烯塑料盆(上下口径分别为15 cm、13 cm，高为18 cm)，每盆定植1株幼苗。

供试土壤为明珠花卉市场购买的营养土，装盆前使用多菌灵进行消毒，土壤农化性状委托新疆农业科学院农业农村部农产品质量监督检验测试中心测定。表1

盆中氮、磷、钾肥均作基肥一次性施入。另外每盆基施8g白云石来调节土壤pH值和补充钙、镁营养；同时每盆基施5mL 霍格兰微量元素混合液以补充土壤微量营养元素[11]。表2

表1 供试土壤农化性状

Table 1 Basic physical and chemical properties of the soil used

项目Project有机质Organicmatter(g/kg)全氮Totalnitrogen(g/kg)水解性氮Hydrolyzablenitrogen(mg/kg)速效磷Availablephosphorus(mg/kg)速效钾Availablepotassium(mg/kg)pH含量Content218.48.18778.83253645.78

表2 硝态氮肥试验设计

Table 2 Design of nitrate nitrogen fertilizer test

处理TrentmentN(g/kg)Ca(NO3)2·4H2O(g/basin)K(g/kg)K2SO4(g/basin)P(g/kg)Ca(H2PO4)2(g/basin)霍格兰Hoagland(mL/basin)白云石Dolomite(g/basin)CK000.200.740.200.6658N10.101.680.200.740.200.6658N20.152.520.200.740.200.6658N30.203.360.200.740.200.6658N40.254.200.200.740.200.6658N50.305.040.200.740.200.6658

1.2.2 播种、育苗、移栽和缓苗

播种时间为2019年3月1日，采用72孔的育苗盘，育苗盘用多菌灵消毒后每穴播种3～5粒均匀、饱满、无病虫害的雪菊种子，轻轻覆盖0.5 cm厚基质。基质配比为草炭∶蛭石∶珍珠岩=3∶1∶1，并用多菌灵消毒后使用。出苗1周后进行间苗，待幼苗长至4～6片叶时，选取大小一致，长势较好的雪菊幼苗进行移栽。于3月25日进行装盆移栽，移栽后在温室里缓苗6 d，4月1日移至室外，此后室外栽培。

1.2.3 生长指标测定

2019年4月28日测定雪菊幼苗的各项生长指标，每个处理选取9株长势均匀一致的雪菊苗进行测定。包括株高、茎粗、鲜重、根冠比、根长、幼苗分枝数(分支含3片以上进行统计)、叶片SPAD值(每个植株随机选取位置相近的3片植株上部叶片，利用SPAD502叶绿素仪测定叶片叶绿素含量并计算其平均值)。

1.2.4 品质测定

鲜样处理：取雪菊幼苗相同部位的叶片(顶端向下3～5叶处)，于液氮中保存，待测。

干样处理：取雪菊幼苗相同部位的叶片和根，分别用烘箱(105℃，30 min)杀青，60℃烘干；将烘干样品粉碎研磨后用封口袋低温保存，待测。

乙醇浸提：准确称取0.500 g雪菊叶和根粉末于带塞三角瓶中，加入70%乙醇25 mL，浸泡24 h后，超声浸提30 min，然后过滤到50 mL容量瓶中，滤渣再超声浸提一次，过滤到原容量瓶中，反复漂洗三角瓶及残渣，最后定容到50 mL，然后放入冰箱，-20℃冷藏保存，待测[6]。

可溶性糖测定：称取叶片处理干样50 mg放入试管，加入15 mL蒸馏水，沸水浴20 min，过滤入100 mL容量瓶中，反复冲洗残渣，定容至刻度。吸取提取液1 mL，加入5 mL蒽酮试剂，摇匀，沸水浴10 min取出冷却，在620 nm波长处测定各溶液的吸光度，代入标准曲线，可求得可溶性糖含量[12]。

可溶性蛋白测定：称取0.2 g叶片处理干样，用5 mL蒸馏水研磨成匀浆后，以8 000 r/min离心10 min，取上清液定容至50 mL。吸取提取液1 mL，加入5 mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置5 min在595 nm波长处测定各溶液的吸光度，代入标准曲线，可求得可溶性蛋白含量[12]。

总黄酮含量测定：吸取乙醇提取液1 mL，置于25 mL比容量瓶中，各加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀放置6 min；加10%硝酸铝溶液1 mL,摇匀放置6 min，加1 mol/L氢氧化钠溶液10 mL，加水至刻度，摇匀，放置10 min后在512 nm波长处测定吸光度，代入标准曲线，可求得黄酮的含量[13]。

绿原酸含量测定：将乙醇提取液稀释5倍后吸取1 mL到10 mL试管中，加70%乙醇定容到l0 mL，摇匀，在328 nm波长处测定各溶液的吸光度，代入标准曲线，可求得绿原酸含量[14]。

1.2.5 PAL酶活性测定

PAL(苯丙氨酸解氨酶)活性测定：参照Koukol和Corm的方法，采用索莱宝公司生产的PAL酶活性测定试剂盒进行PAL活性测定。称取叶片鲜样0.100 g，加入1 mL酶提取液，冰浴研磨成匀浆，转移到离心管中，10 000 g，4℃离心10 min，取上清液，置于冰上待测。按照试剂盒说明加入反应试剂，30℃水浴30 min后，加入终止反应试剂，静止10 min后，用对照管调零，在290 nm波长处记录测定管吸光值，代入公式可求得PAL酶活性[15]。

1.3 数据处理

利用Excel 2010软件对数据进行整理和作图，采用IBM SPSS Statistics 20.0软件进行方差分析及显著性差异比较。

2 结果与分析

2.1 不同硝态氮处理对雪菊幼苗生长的影响

研究表明,施硝态氮对雪菊幼苗株高、茎粗、鲜重均有促进作用，与CK相比，株高、茎粗、鲜重均高于CK。N4、N5处理的株高、茎粗与CK存在极显著差异；不同处理的鲜重与CK均存在极显著差异，但N1、N2、N3处理之间无明显差异。N4处理的株高达到最大值，为7.26 cm；N5处理的茎粗与鲜重最大，分别为0.40 cm、4.00 g。施硝态氮对雪菊幼苗的根冠比及根长具有一定的抑制作用，不同处理的根冠比与CK存在显著差异，除N2处理外，其他处理达到了极显著差异；除了N1处理，其他处理的根长与CK存在极显著差异；N3处理的根冠比值最小，为0.38；N5处理的根长值最小，为12.14 cm。施硝态氮有利于雪菊幼苗地上部分的生长，而不施或少施硝态氮对根的生长具有一定的促进作用。表3

表3 不同硝态氮处理下雪菊幼苗生长变化Table 3 Effect of nitrate nitrogen treatment on the growth ofCoreopsistinctoriaseedlings

处理Treatment株高Plantheight(cm)茎粗Stemdiameter(cm)鲜重Freshweight(g)根冠比Root-shootratio根长Rootlength(cm)CK6.01±0.10Bb0.28±0.01Bb1.54±0.05Dd0.52±0.06Aa13.82±0.25AaN16.11±0.05Bb0.30±0.03Bb2.20±0.12Cc0.40±0.02Bb13.70±0.21AaN26.02±0.10Bb0.31±0,02Bb2.12±0.19Cc0.44±0.03ABb12.45±0.14CcN36.04±0.11Bb0.31±0.02Bb2.02±0.15Cc0.38±0.04Bb13.09±0.20BbN47.26±0.16Aa0.37±0.02Aa3.17±0.31Bb0.41±0.03Bb12.51±0.13CcN57.18±0.23Aa0.40±0.02Aa4.00±0.18Aa0.40±0.05Bb12.41±0.20Cc

注:同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，下同

Note:Different lowercase letters after the same column data indicate significant difference (P<0.05),and different uppercase letters indicate that the difference is extremely significant (P<0.01),the same below

2.2 不同硝态氮处理对雪菊幼苗分枝数和SPAD值的影响

研究表明,施硝态氮对雪菊幼苗分枝数和SPAD值均有促进作用，幼苗分枝数和SPAD值与CK相比均高于CK。除N3处理外，其他处理的幼苗分枝数与CK存在显著差异，N1、N4、N5处理与CK达到了极显著差异；N5处理的SPAD值与CK存在极显著差异。N5处理的幼苗分枝数和SPAD值达到了最大，分别为9.11和48.92。施硝态氮有利于促进雪菊幼苗分枝和提高叶绿素含量。表4

表4 不同硝态氮处理下雪菊幼苗分枝数和SPAD值变化

Table 4 Effect of nitrate nitrogen treatment on branching number and SPAD value ofCoreopsistinctoriaseedlings

处理Treatment分枝数Numberofbranching叶绿素含量(SPAD值)Chlorophyllcontent(SPADvalue)CK7.56±0.20Cc44.67±0.74BbN18.33±0.33ABb46.67±1.55ABabN28.23±0.51ABCb46.82±1.30ABabN38.11±0.19BCbc45.11±1.23ABbN49.00±0.33ABa46.47±1.63ABabN59.11±0.38Aa48.92±1.73Aa

2.3 不同硝态氮处理对雪菊幼苗代谢产物的影响

2.3.1 可溶性糖

研究表明,与CK相比，各处理叶片中可溶性糖含量略高于CK，但各处理与CK相比无明显差异。N4处理可溶性糖含量达到了最大，为32.63%，与CK相比增加17.33%。试验表明施硝态氮对雪菊幼苗叶片中可溶性糖含量具有一定促进作用。表5

2.3.2 可溶性蛋白

研究表明,随着硝态氮处理浓度的增加，雪菊幼苗叶片中可溶性蛋白含量均高于CK且基本呈现上升趋势，各处理与CK相比达到了极显著差异。N5处理可溶性蛋白含量达到了最大，为8.86 mg/g，与CK相比增加51.97%。施硝态氮对雪菊幼苗叶片中可溶性蛋白含量具有显著促进作用。表5

表5 不同硝态氮处理下雪菊幼苗可溶性糖与可溶性蛋白变化

Table 5 Effect of nitrate nitrogen treatment on soluble sugar and soluble protein inCoreopsistinctoriaseedlings

处理Treatment可溶性糖Solublesugarcontent(%)可溶性蛋白Solubleproteincontent(mg/g)CK27.81±0.76Aa5.83±0.19CcN131.22±0.87Aa7.81±0.39BbN230.50±3.69Aa8.31±0.42ABabN329.52±1.86Aa8.20±0.41ABabN432.63±2.08Aa8.73±0.27AaN530.14±3.03Aa8.86±0.43Aa

2.3.3 总黄酮含量

研究表明,与CK相比，各处理叶片和根中总黄酮均低于CK，且叶片中黄酮下降较为明显。各处理叶片中黄酮含量与CK存在极显著差异，除N1处理外，根中黄酮含量与CK存在显著差异，N3、N4、N5处理达到了极显著差异。N3处理叶片中黄酮含量最小，为69.75 mg/g，与CK相比下降23.10%。N5处理根中黄酮含量最小，为27.23 mg/g，与CK相比下降21.68%。施硝态氮对雪菊幼苗叶片及根中黄酮含量具有显著抑制作用。表6

2.3.4 绿原酸含量

研究表明,与CK相比，各处理叶片中绿原酸含量均低于CK且基本呈现下降趋势，除N1处理外，其他处理与CK存在极显著差异。N5处理叶片中绿原酸含量最小，为8.55 mg/g，与CK相比下降21.20%。施硝态氮对雪菊幼苗叶片中绿原酸含量具有抑制作用，且施氮量越大抑制作用越明显。表6

表6 不同硝态氮处理下雪菊幼苗总黄酮与绿原酸变化

Table 6 Effect of nitrate nitrogen treatment on total flavonoids and chlorogenic acid inCoreopsistinctoriaseedlings

处理Treatment叶中总黄酮Totalflavonoidsinleaves(mg/g)根中总黄酮Totalflavonoidsinroot(mg/g)绿原酸Chlorogenicacid(mg/g)CK90.70±2.02Aa34.77±1.22Aa10.85±0.63AaN181.37±2.25Bb32.95±1.82ABab9.77±0.45ABabN279.28±2.31Bb31.56±1.35ABbc9.15±0.23BbcN369.75±3.72Cc29.69±1.89BCcd8.95±0.60BbcN479.15±3.11Bb29.55±0.67BCcd9.12±0.80BbcN578.03±3.98Bb27.23±0.85Cd8.55±0.77Bc

2.4 不同硝态氮处理对雪菊幼苗PAL活性的影响

植物的代谢分为初生代谢和次生代谢，其中植物的次生代谢有多条途径，苯丙烷类代谢途径是黄酮类化合物的合成代谢必经的途径。其中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(C4H)和4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL) 是这一途径中的3个关键酶，其活性直接影响到产物的合成数量[16]。苯丙氨酸解氨酶是连接初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶，是苯丙烷类代谢的关键酶和限速酶，也是苯丙烷类代谢途径中研究最多的酶。图1

图1 硝态氮处理下雪菊幼苗叶片PAL活性变化

Fig.1 Effect of nitrate nitrogen treatment on PAL activity in leaves ofCoreopsistinctoriaseedlings

与CK相比，各处理叶片的PAL活性均低于CK，N4、N5处理叶片的PAL活性与CK存在显著差异，但处理之间没有明显差异。N5处理叶片的PAL活性最低，与CK相比下降10.76%。施硝态氮对雪菊幼苗叶片PAL活性具有抑制作用，且施氮量多的抑制作用较为明显。图1

3 讨 论

氮素作为植物最重要的营养元素之一，对植物的生长的影响较为直观。研究结果表明，施硝态氮有利于促进雪菊幼苗地上部分生长，对地下部分生长具有一定的抑制作用。N5处理的株高、茎粗、鲜重、幼苗分枝数、叶绿素含量(SPAD值)等表现最佳，这与李志元、姜雅爽等研究结果基本一致[8,17]。Eriession和Vander研究发现，缺氮条件下，植物地上部生长受到抑制，植物加强碳水化合物的运输到根部，促进根部的生长以获得有限的限制性营养，从而增加根冠比[18-19]。林文等[20]研究发现，缺氮条件下还会诱发侧根及新根的发育。研究结果表明，不施硝态氮有利于雪菊幼苗根冠比和根长的增加。

研究表明，随着硝态处理浓度的增加雪菊幼苗叶片可溶性蛋白呈现上升趋势，但对叶片中绿原酸、总黄酮以及根中总黄酮含量表现为抑制作用。这与刘大会等[21]在药用菊花中的研究结果一致，不施硝态氮叶片中绿原酸、总黄酮以及根中总黄酮含量表现最佳[21]。施硝态氮对雪菊幼苗可溶性糖有一定促进作用，这与谢晋等[22]在烤烟中研究结果一致，试验N4处理的可溶性糖表现最佳。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是连接初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶，其活性对黄酮、绿原酸等次生代谢的合成有重要影响。试验研究表明，施硝态氮对PAL活性具有抑制作用，且处理浓度较高的抑制作用较为明显，这与刘伟等在杭白菊中的研究结果一致[11]，试验N5处理的PAL活性最低，与CK相比下降了10.76%。

氮素作为植物最重要的营养元素之一，对植物的生长及代谢有重要影响，农业生产中合理施用氮肥是增产增收的重要手段。然而，植物在整个生育期对氮肥的需求并不相同，不同时期的合理施氮更有利于提高作物的产量和品质。雪菊苗期施硝态氮肥，可以提高雪菊幼苗叶片中蛋白质和叶绿素含量，增强其光合作用，促进可溶性糖含量的积累，为生长和代谢提供基础。但施硝态氮肥对PAL活性具有抑制作用，导致PAL 活性降低，从而影响了黄酮、绿原酸的合成数量的下降。雪菊幼苗期中黄酮、绿原酸等影响品质的代谢产物含量是否影响生殖期雪菊花的品质还有待研究。

4 结 论

雪菊苗期施硝态氮肥，可以提高雪菊幼苗叶片中蛋白质和叶绿素含量，从而增强其光合作用，促进可溶性糖含量的积累，为生长和代谢提供基础。但施硝态氮肥对PAL活性具有抑制作用，导致PAL 活性降低，从而影响了黄酮、绿原酸合成的数量下降。

N5处理茎粗、鲜重、分枝数、SPAD、可溶性蛋白含量均为最大值，分别为0.40 cm、4.00 g、9.11 、48.92 、8.86 mg/g。N4处理株高和可溶性糖含量为最大值，分别为7.26 cm和32.63%。而根冠比、根长、叶中黄酮、根中黄酮、叶中绿原酸最大值均为CK，分别为0.52、13.82 cm、90.70 mg/g、34.77 mg/g、10.85 mg/g。CK处理中黄酮和绿原酸含量较高，但不施硝态氮肥严重限制了雪菊幼苗的生长和干物质积累，CK处理中株高、茎粗、鲜重、分枝数、SPAD、可溶性糖、可溶性蛋白均为最小值，分别为6.01 cm、0.28 cm、1.54 g、7.56、44.67、27.81%、5.83 mg/g。雪菊幼苗期黄酮、绿原酸等影响品质的代谢产物含量是否影响生殖期雪菊花的品质还有待研究，幼苗期生物量的积累是雪菊后期生长发育以及产量形成的保证。硝态氮施用量以N4、N5为宜即0.25 ～0.3 g/kg营养土。