SSR标记马铃薯育成品种的遗传多样性分析

王 鹏，李芳弟，郭天顺，窦俊焕，颉炜清，罗照霞，齐小东，杨 晨，赵中梁，宋 怡，吕 汰

（甘肃省天水市农业科学研究所，甘肃 天水 741001）

随着马铃薯主粮化发展和加工业企业兴起的需要，育成的品种除具备抗病、高产特性外，还需适宜食品加工（炸片、炸条、淀粉、全粉）和鲜薯出口。甘肃省天水市农业科学研究所由于马铃薯种质资源保存与利用滞后，育种缺乏优质亲本，现已育成品种主要以甘肃省平凉市庄浪县农机推广中心育成的品种‘庄薯3 号’和甘肃省天水市农业科学研究所自育品系‘天99-5-4’为亲本。

种质的价值决定于种质自身的遗传多样性、可利用性和有效性[1]。在育种实践中，环境及人为因素的影响使得选择过程操作起来较为困难，而利用DNA指纹差异则可直接提供与目标性状有关的DNA水平信息，避免了环境干扰，从而大大提高了杂交育种对亲本及后代理想单株的选择效率[2]。国外分子标记技术用于马铃薯遗传多样性研究较早[3-6]。近年来，Gavrilenko等[7]利用SSR标记技术对237份具有栽培马铃薯特性的种质和155份具有野生种特性并接近栽培种种质的遗传多样性进行分析，并分析其与野生种的遗传关系，结果表明，所有的材料聚为A、B 两大类，A 类包括了具有二倍体、三倍体和四倍体的栽培种和部分具有野生型亲本的种质，B类包括大部分的野生型种质和杂交栽培种。国内分子标记技术用于马铃薯遗传多样性研究相比国外较晚[8-14]。Wang Fang 等[15]利用AFLP 分子标记技术对123份引自国际马铃薯中心（CIP）及部分国内育成马铃薯品种进行遗传多样性分析，结果表明，CIP引进马铃薯种质遗传多样性丰富，中国马铃薯品种遗传相似度较高，遗传基础狭窄，可以利用CIP资源来拓宽中国马铃薯狭窄的遗传基础。

为了扩大马铃薯种质资源基因库，迎合中国马铃薯主食化发展及对主食化品种的需求，甘肃省天水市农业科学研究所近两年收集并引进不同基因型的马铃薯资源。为进一步将这些资源材料用于马铃薯育种亲本的选配中，本研究利用引进的国内育成马铃薯品种以及甘肃省主要育成的部分马铃薯品种，用SSR分子标记检测方法对其遗传关系进行研究，明确甘肃省部分马铃薯栽培品种与引进马铃薯品种的遗传多样性，为拓宽甘肃省马铃薯育成品种遗传基础提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 参试材料

马铃薯品种共计65个（表1），包括甘肃省育成品种14个，引进马铃薯品种47个，甘肃省天水市地方品种4个。

1.2 马铃薯基因组DNA的提取

摘取马铃薯田间幼嫩叶片，利用改良的CTAB法[16]提取马铃薯基因组DNA。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的质量和完整性。

1.3 SSR引物筛选

采用轮筛法筛选多态性较好的引物，第1轮随机选取‘天薯11号’和‘中薯18号’，SSR引物来自于公开发表的文献[6,17,18]，从100对引物中筛选出在两份材料间有条带的引物；第2轮以5份材料（‘天薯10号’、‘陇薯7号’、‘中薯10号’、‘云薯506’、‘丽薯10号’）进一步筛选出多态性指数较高的引物，引物多态性指数PPB（Percentage of polymorphic bands）：PPB（%）=（K/N）×100，（其中K 为扩增多态性条带数，N为扩增条带总数）。用筛选出的多态性指数较高的SSR引物对供试马铃薯品种进行扩增分析。

表1 供试材料名称及来源Table 1 Names and sources of materials

续表1Continued Table 1

1.4 PCR扩增和电泳检测

1.4.1 PCR扩增体系

PCR 反 应在Eppendorf Master-cycler PCR 扩增仪上进行。SSR反应体系和程序按照Ghislain等[6]的方法，SSR-PCR体系（10 μL）：2×Taq PCR Master Mix（中科瑞泰生物科技有限公司）5 L，10 ng/μL上游引物和下游引物各1 μL，100 ng/μL 模板DNA 1 μL，ddH2O 2 μL。反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，复性（以引物最适退火温度而定）50 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。

1.4.2 PAGE凝胶电泳检测

采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行电泳（恒功率70 W 电泳1.5 h）。凝胶染色步骤：ddH2O 漂洗2～3 min，2 g/L 硝酸银染色15 min，蒸馏水漂洗30 s，20 g/L氢氧化钠中加入37%甲醛4 mL显色至条带清晰可见，蒸馏水漂洗，照相。

1.5 SSR数据统计分析

对扩增后清晰、稳定、易读的条带采用‘0-1’系统记录其位置，在相同的迁移位置上有带记‘1’，无带记‘0’，构建‘0,1’二元数据矩阵。利用NTSYS-pc 2.1遗传多样性分析软件计算供试材料之间的遗传相似系数，按照UPGMA（Un-weighted pair group method using arithmetic averages）方法进行聚类分析，并通过Tree plot模块生成聚类图。

2 结果与分析

2.1 SSR多态性引物筛选

筛选出25对多态性指数较高的马铃薯SSR引物（表2）。

2.2 SSR标记多态性分析

利用筛选出的25 对多态性指数较高的SSR 引物，对65 份马铃薯品种进行SSR 扩增分析。扩增结果显示，25 对引物共检测出145 个清晰、稳定、易读的条带，引物扩增条带数为3～12 个，平均每对引物扩增出5.88 个条带，其中，多态性条带145 个，平均多态性比率为100%。引物STI005扩增出的条带数最多（12个），扩增条带数最少的为引 物STM1104、STGBSS、SSR594、STM1106 和STI052，条带总数均为3 个（表2）。图1 为引物STI052对部分马铃薯基因型的扩增结果。

表2 马铃薯品种SSR分析的多态性引物序列Table 2 Polymorphic primer sequences of potato variety SSR analysis

图1 引物STI052对部分马铃薯品种的SSR扩增Figure 1 SSR amplification of some potato varieties by Primer STI052

2.3 供试马铃薯品种的亲缘关系

用NTSYS-pc 2.1数据分析软件计算了65份供试马铃薯品种两两之间的遗传相似系数（Genetic similarity,GS）在0.60～0.93，平均遗传相似系数为0.76。基于遗传相似系数用类平均法（UPGMA）对供试材料进行聚类，结果表明（图2），在GS 为0.60时，供试材料分为两大类，‘华恩1 号’单独聚为一类，该品种为华中农业大学、湖北恩施中国南方马铃薯研究中心从杂交组合‘395049’的子代实生系中选择优良单株经无性繁殖而成的品种。其余64 份材料聚为第二类；在GS 为0.61 时，第二类又分为两个亚类，‘农天1 号’、‘甘谷紫’、‘天薯9 号’、‘五龙洋芋’、‘天薯10 号’聚为第一亚类；其余59份材料聚为第二亚类；‘农天1号’、‘天薯9号’和‘天薯10号’为甘肃省天水市农业科学研究所先后选育的品种，‘农天1号’和‘天薯10号’共同亲本是‘庄薯3号’，其中，‘甘谷紫’和‘五龙洋芋’均为天水地方品种。在GS为0.64时，第二亚类又分为2个亚亚类：第1亚亚类为‘天薯11号’、‘青薯10号’、‘青薯6号’、‘甘谷红’和‘秦州红’，其中，青海省农业科学院作物研究所育成的‘青薯10号’和‘青薯6 号’相似系数最高，达0.93，搜集于甘肃省天水市不同的两个县区的地方品种‘甘谷红’和‘秦州红’相似系数较高，达0.88，其外观（薯型、薯皮、芽眼等）有一定的相似性，其余54 份材料聚为第2 亚亚类：在GS为0.65时，‘延薯系列（延薯4、7、8、9、10）’、‘鄂马铃薯11号’和‘米拉’7份材料被聚为一组，在GS为0.66时，‘陇薯13号’和‘夏波蒂’，‘红玫瑰’、‘希森6号’、‘克新22号’和‘苏兰1号’分别聚在一起，其余41 份材料（占供试材料的63.08%）：在GS 为0.67 时，‘中薯7 号’、‘虎头’、‘中薯18号’、‘大西洋’、‘早大白’、‘鄂薯5号’、‘丽薯6号’、‘云薯605’、‘宣薯5号’、‘中薯19号’、‘川凉薯7号’、‘毕薯2号’和‘克新6号’13份材料聚在一起，在GS为0.68时，‘青薯2号’、‘冀张薯14号’、‘冀张薯8号’、‘云薯201’、‘蒙薯17号’、‘蒙薯10号’、‘中薯3号’、‘郑薯7号’、‘农天2号’、‘中薯10号’、‘中薯11号’、‘天薯13号’、‘青薯9号’、‘希森5号’、‘希森3号’、‘陇薯12号’、‘费乌瑞它’、‘冀张薯12号’和‘陇薯6号’19份材料聚为一组，在GS为0.70时，‘陇薯8号’、‘陇薯7号’、‘庄薯4号’、‘肯德’、‘天薯12号’、‘中薯8号’、‘陇薯10号’、‘青薯7号’和‘讷薯16号’9份材料聚在一起。来自于美国的薯片加工型品种‘大西洋’、来自于德国的中晚熟品种‘米拉’、来自于加拿大的薯条加工型品种‘夏波蒂’与国内育成品种的遗传差异并不十分明显，这可能是由于这些品种被引进国内后，将其作为亲本反复利用，与国内育成品种做过很多杂交，因此，育成品种中有其血缘，遗传关系较近，遗传差异较小。

图2 供试马铃薯品种的聚类Figure 2 Cluster analysis of tested potato varieties

就供试马铃薯品种的遗传距离（Genetic distance，GD）来看，乐陵希森马铃薯产业集团有限公司育成的早熟马铃薯品种‘希森3号’与甘肃省天水市农业科学研究所育成的晚熟淀粉加工型品种（淀粉含量达19.44%）‘天薯10 号’、甘肃农业大学与天水市农业科学研究所合作育成的鲜食菜用型马铃薯品种‘农天1号’遗传距离最大（GD=1.000 0），‘希森3号’与‘天薯9号’差异也较大；‘天薯10 号’与‘红玫瑰’、‘希森3 号’与‘五龙洋芋’亲缘关系最远，遗传距离最大，均为0.922 4，‘农天1号’与早熟品种‘费乌瑞它’（GD=0.862 5）、‘红玫瑰’、‘延薯4号’、‘云薯605’遗传差异均较大，亲缘关系较远；‘天薯10 号’与‘延薯10 号’（GD=0.853 7）、‘肯德’、‘夏波蒂’的亲缘关系均较远，遗传距离均大于0.800 0，其次，‘天薯10号’与‘米拉’、‘延薯9号’、‘蒙薯10号’、‘陇薯12号’、‘中薯7号’、‘中薯19号’、‘苏兰1号’、‘希森5号’、‘中薯3号’、‘云薯605’遗传差异也较大，‘天薯10号’和‘农天1号’是当地育种单位重要的育种亲本，在马铃薯杂交育种中，可以利用‘天薯10号’、‘农天1号’与上述遗传差异较大的品种进行杂交选配工作，进而为选育出综合性状优异的马铃薯新品种奠定基础。部分供试马铃薯品种的遗传距离见表3。

3 讨 论

马铃薯品种来源、遗传距离和遗传背景差异较大的在聚类图（图2）中被分离出聚为一类，如‘华恩1号’、‘天薯11号’、‘鄂马铃薯11号’等。来源相同或同一育种单位的育成品种，遗传差异较小、距离较近，如甘肃天水地方品种和育成品种‘农天1号’、‘天薯9号’、‘天薯10号’、‘甘谷紫’和‘五龙洋芋’聚在一起，‘延薯4号’、‘延薯7号’、‘延薯8号’、‘延薯9号’和‘延薯10号’聚在一起，‘青薯10号’和‘青薯6 号’、‘青薯7 号’和‘讷薯16 号’、‘中薯10号’和‘中薯11 号’、‘蒙薯10 号’和‘蒙薯17 号’、‘冀张薯8号’和‘冀张薯12号’分别聚在一起。这可能由于相同栽培区域和各育种单位集中化利用亲本，所以同一个育种单位培育的品种大多聚在相同类群中，该结果与时启冬等[19]和段艳凤等[20]的研究结果一致。比如，‘延薯9号’是吉林省延边朝鲜族自治州农业科学研究院以‘延薯8 号’为母本、‘早大白’为父本育成的中晚熟品种，‘延薯7号’是以‘延薯4号’为母本、‘早大白’为父本，有性杂交获得实生籽，经过各世代鉴定筛选而育成。所以都聚在一起，由此也证明了SSR分子标记方法在作物品种血缘关系分析中的准确性与可靠性。

在本研究中有些聚类分析结果与实际的亲缘关系不太符合，如‘青薯10号’和‘青薯6号’在本研究中相似系数较高，两个品种均为青海省农业科学院作物研究所先后选育而成，‘青薯10号’是从国际马铃 薯 中 心（CIP）引 进 杂 交 组 合（‘387521.3’בAphrodite’）材料‘C92.140-05’中选出优良单株ZT，后经系统选育而成，而‘青薯6号’亲本为‘固33-1’和‘92-9-44’（‘73-21-1’בDesiree’），两个品种没有共同的亲本，此结果的产生可能与研究中所选的SSR引物及其数量有关，扩增获得的多态性条带有限，不能充分表现出材料之间真实的遗传关系。

也有不同来源的品种相似性较高，如‘大西洋’和‘中薯18号’、‘费乌瑞它’和‘冀张薯12号’、‘中薯3号’和‘郑薯7号’、‘陇薯7号’和‘庄薯4号’等，‘中薯18 号’是中国农业科学院蔬菜花卉研究所用‘C91.628’בC93.154’选育的品种，‘大西洋’亲本为‘B5141-6’（Lenape）בWauseon’，是1978 年由农业部和中国农业科学院引入中国，这很可能是不同育种单位间相互引种，共用亲本，使得这些品种具有共同的血缘，遗传差异较小。但是，部分血缘关系较近的品种相似性却不高，比如，早熟品种‘郑薯7 号’为河南省郑州市蔬菜研究所利用‘费乌瑞它’为母本、‘豫马铃薯1号’为父本育成，炸片加工型品种‘大西洋’为‘冀张薯12号’的母本，可是，

在本研究中，‘郑薯7号’与其母本早熟品种‘费乌瑞它’、‘冀张薯12号’与‘大西洋’却相聚较远，这可能是杂交后代中群体分离比较大，使其与亲本间发生了较大的遗传差异。

表3 部分供试马铃薯品种的遗传距离Table 3 Genetic distance of some potato varieties

马铃薯在中国属于外来作物，因此，马铃薯种质资源十分有限，本研究通过对甘肃省主要育成马铃薯品种和引进品种的遗传多样性进行分析，发现部分引进主食化马铃薯品种与甘肃省育成品种遗传差异较大，是较好的亲本资源，应加大其今后在马铃薯育种中的应用。