膜联蛋白A7水平在胃癌患者癌组织及外周血液中的变化及其临床意义

叶卫华，袁虎方

（河北医科大学第四医院 1.超声科 2.外三科，河北 石家庄 050011）

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，2015年胃癌位居全国癌症发病及死亡的前两位，严重威胁着人民的健康和生活质量[1]。胃癌早期症状多不明显，并且缺乏简易、敏感的筛查手段，超过半数患者在确诊时已属晚期，失去根治手术机会。探讨胃癌的分子机制对预防、早期诊断和治疗都具有十分重要的意义。膜联蛋白（annexin，ANX）超家族成员中的膜联蛋白A7（ANXA7）具有广泛的生物学功能，包括膜转运、细胞分化、凋亡、生长调节及钙离子信号途径等[2-3]。许多研究已证实，ANXA7在胃癌中呈高表达[4]。本文应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）及Western blot检测胃癌组织和其配对癌旁组织中ANXA7 mRNA和蛋白的表达情况；应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测胃癌患者及正常人血清中ANXA7水平，探讨ANXA7在胃癌中的表达及其与临床病理因素的关系，旨在寻找一种新的胃癌标记物。

1 资料与方法

1.1 病例资料

选取2013年1月—2015年12月河北医科大学第四医院外三科因胃癌入院行根治术并术后病理证实为胃腺癌的患者105例，其中男70例，女35例；年龄35～80岁，平均（60.18±8.23）岁；所有患者均除外合并其他恶性肿瘤以及术前接受放疗、化疗和生物治疗的患者；收集术前晨起空腹血、新鲜胃癌组织及其癌旁组织手术标本。同期体检的正常人50例取血清作为正常对照组，两组性别、年龄无统计学差异（均P＞0.05）。研究方案预先经河北医科大学第四医院伦理委员会批准。

1.2 试剂

ANXA7 ELISA试剂盒购自美国Uscnlife Science & Technology公司，TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司，MMLV逆转录试剂盒及荧光定量qRT-PCR试剂盒购自美国Promega公司，PCR引物购自北京鼎国生物技术有限责任公司，兔抗人ANXA7多克隆抗体购自Proteintech Group公司，GAPDH一抗购自美国ImmunoWay公司。

1.3 标本制备

取胃癌患者、正常对照组晨起空腹静脉血4 mL置于促凝管中，静置15 min后在3 000r/min离心15 min，取血清置于-20 ℃准备检测血清ANXA7水平。105例胃癌患者术后病理证实均为胃腺癌；癌旁组织取自距离癌灶5 cm处，术后病理证实均为正常胃壁组织。每个标本取下后迅速放入液氮速冻后转入-80 ℃低温冰箱保存。同时收集患者临床资料，记录以下参数：年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤最大直径、浸润深度、肿瘤的分化程度、淋巴结转移情况、TNM分期等。

1.4 组织中ANXA7 mRNA检测

TRIzol法提取胃癌组织及其癌旁组织的总RNA，琼脂糖凝胶电泳进行RNA完整性鉴定，使用NanoDrop紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度。按照Promega公司M-MLV逆转录酶试剂盒说明书进行反转录反应，42 ℃，65 min；70 ℃，5 min，合成cDNA。然后进行PCR，PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火34 s，72 ℃延伸25 s，进行40个循环。95 ℃变性15 s，57℃退火1 min，95 ℃延伸30 s终止。ANXA7上游引物：5'-GTA TCC ACA GCC ACC TTC ACA GTC-3'；下游引物：5'-TCC AAA DAA ACA GGA GAG AAA ACA G-3'。GAPDH上游引物：5'-CGC TGA GTA CGT CGT GGA GTC-3'；下游引物：5'-GCT GAT GAT CTT GAG GCT GTT GTC-3'。设定GAPDH为内参照基因，采用相对定量的方法（2-ΔΔCt法）来衡量目的基因的mRNA表达水平。

1.5 组织中ANXA7蛋白检测

取2 mg胃癌组织或癌旁组织，预冷1×PBS中漂洗剪碎，弃去PBS，加入1 mL组织/细胞裂解液（1%NP40，150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris·HCl，pH7.5，10%甘油，1 mmol/L Na3VO4，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L DTT），冰上匀浆，裂解30 min，中间间断涡旋混匀。4 ℃ 8 000r/min离心10 min，收集上清，-80 ℃保存。采用BCA法进行蛋白定量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）将蛋白质条带转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉的TTBS（10 mmol/L Tris·HCl，pH8.0，150 mmol/L NaCl，0.05% Tween-20）封闭液中室温封闭2 h，浸于含有一抗的TTBS液中，4 ℃缓慢振摇过夜。TTBS洗膜3次，10 min/次。置入荧光二抗（1:10 000）溶液中，室温避光孵育2 h。放入盛有适量TTBS的平皿中，室温振摇洗膜，每次10 min，共3次。采用Odyssey双色红外激光成像系统进行扫描并计算条带的积分吸光度值，以目的条带灰度值与对应GAPDH的灰度值之比作为目的蛋白表达强弱的指标。

1.6 血清ANXA7水平测定

ANXA7试剂盒采用ELISA法，为美国USCN试剂有限公司产品，批号：30722，R＞0.99，检测范围：最小检测量为7.0 ng/L；板内变异系数＜7%、板间变异系数均＜9%。严格依据试剂盒的说明书进行操作。酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。

1.7 统计学处理

所有统计学分析使用SPSS 19.0软件进行处理。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两样本间的比较采用t检验，多个样本间比较则采用单因素方差分析。两两比较时，若方差齐，则采用LSD法；若方差不齐，则采用Dunnett T3法。胃癌组织及外周血中ANXA7表达的相关性采用Pearson相关分析。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 ANXA7在胃癌组织中的表达情况

应用qRT-PCR技术检测105对胃癌组织和配对癌旁组织中ANXA7 mRNA的表达，结果显示ANXA7 mRNA在胃癌组织中的表达量明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（t=17.361，P=0.000）（图1）。Western blot检测105对胃癌组织和配对癌旁组织中ANXA7蛋白的表达，结果显示ANXA7蛋白在胃癌组织中的表达量显著高于癌旁组织，差异有统计学意义（t=15.368，P=0.000）（图2）。

图1 ANXA7mRNA在胃癌组织和癌旁组织中的相对表达量Figure 1 The relative expression levels of ANXA7 mRNA in gastric cancer tissue and adjacent non-cancerous tissue

图2 ANXA7蛋白在胃癌组织和癌旁组织中的相对表达量Figure 2 The relative expression levels of ANXA7 protein in gastric cancer tissue and adjacent non-cancerous tissue

2.2 ANXA7在胃癌患者血清中的水平

应用ELISA法检测胃癌组与正常对照组血清中ANXA7蛋白水平，胃癌组血清ANXA7蛋白浓度为（78.620±11.249）ng/L，正常对照组为（54.971±9.548）ng/L，结果显示胃癌组血清ANXA7蛋白浓度明显高于正常对照组，差异有统计学意义（t=12.823，P=0.000）（图3）。

图3 ELISA法检测胃癌患者和正常人血清ANXA7表达水平Figure 3 Serum levels of ANXA7 in patients with gastric cancer and healthy subjects detected by ELISA

2.3 ANXA7与胃癌临床病理因素的关系

胃癌组织中ANXA7的mRNA和蛋白表达水平在性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、病理类型等方面差异均无统计学意义（均P＞0.05）；在不同分化程度的胃癌组织中差异有统计学意义（P＜0.05），且随着分化程度越低，表达水平越高；在不同肿瘤浸润深度的组织中，只有T1和T4期组织中ANXA7的mRNA和蛋白表达水平差异有统计学意义（均P＜0.05）；在有淋巴结转移的胃癌组织中ANXA7的mRNA表达水平比无淋巴结转移的胃癌组织中的高，两者差异有统计学意义（P＜0.05），但ANXA7的蛋白表达水平在两者中差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。胃癌患者血清中ANXA7水平在性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、病理类型等方面差异均无统计学意义（均P＞0.05）；在不同分化程度、不同临床分期、有无淋巴结转移的胃癌中差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表1 胃癌组织中ANXA7表达与胃癌患者临床病理因素的关系（±s）Table 1 The relationship between ANXA7 expression in gastric cancer tissue and clinicopathologic variables of gastric cancer patients (±s)

表1 胃癌组织中ANXA7表达与胃癌患者临床病理因素的关系（±s）Table 1 The relationship between ANXA7 expression in gastric cancer tissue and clinicopathologic variables of gastric cancer patients (±s)

临床病理因素 n ANXA7 mRNA表达量 P ANXA7蛋白表达量 P性别男 70 3.714±1.561 0.979 0.501±0.275 0.478女 35 3.705±1.728 0.461±0.271年龄（岁）≥60 60 3.678±1.604 0.809 0.479±0.262 0.696＜60 45 3.755±1.637 0.500±0.289肿瘤大小（cm）≥5 79 3.719±1.523 0.924 0.483±0.259 0.736＜5 26 3.685±1.886 0.504±0.317肿瘤位置胃窦 57 3.991±1.558 0.063 0.504±0.264 0.296胃体 22 3.105±1.405 0.431±0.270幽门 11 3.346±1.840 0.453±0.289贲门 10 3.263±1.806 0.445±0.289胃底 5 4.880±1.256 0.712±0.194病理类型溃疡型 74 3.547±1.619 0.129 0.462±0.282 0.240浸润型 23 3.891±1.604 0.525±0.259隆起型 8 4.704±1.270 0.617±0.189分化程度高分化 24 1.485±0.513 0.000 0.099±0.012 0.000中分化 38 3.465±0.821 0.405±0.020低分化 43 5.170±0.789 0.779±0.071 T分期T1 11 2.337±1.446 0.004 0.275±0.240 0.020 T2 16 3.251±1.401 0.503±0.287 T3 21 3.693±1.469 0.441±0.279 T4 57 4.111±1.598 0.542±0.256淋巴结转移阳性 56 4.098±1.403 0.008 0.527±0.242 0.117阴性 49 3.268±1.729 0.443±0.302

表2 胃癌患者血清AXNA7水平与临床病理特征的关系（±s）Table 2 The relationship between serum ANXA7 level and clinicopathologic features of gastric cancer patients(±s)

表2 胃癌患者血清AXNA7水平与临床病理特征的关系（±s）Table 2 The relationship between serum ANXA7 level and clinicopathologic features of gastric cancer patients(±s)

临床病理特征 n AXNA7浓度（ng/L） P性别男70 79.31±11.77 0.427女35 77.25±10.14年龄 (岁)≥60 60 78.99±11.98 0.344＜60 45 78.12±10.31肿瘤大小 （cm）≥5 79 79.17±11.54 0.771＜5 26 76.95±10.36肿瘤位置胃窦 57 79.93±10.81 0.700胃体 22 80.71±12.91幽门 11 76.36±11.79贲门 10 79.77±10.59胃底 5 77.07±10.55病理类型溃疡型 74 79.23±12.45 0.392浸润型 23 75.18±11.60隆起型 8 72.55±10.08分化程度高分化 24 54.57±9.74 0.000中分化 38 73.48±13.40低分化 43 80.93±11.81 T分期T1 11 64.14±14.71 0.000 T2 16 75.58±11.93 T3 21 78.45±11.73 T4 57 80.04±12.06淋巴结转移阳性 56 77.28±13.22 0.003阴性 49 80.01±8.35

2.4 胃癌患者癌组织与血液中ANXA7蛋白水平的相关性

对胃癌组织ANXA7蛋白表达与外周血中ANXA7蛋白水平进行Pearson相关分析，结果发现胃癌组织与外周血中ANXA7水平有正相关关系（r=0.789，P=0.001）。

2.5 血清ANXA7蛋白水平对胃癌的诊断效能

为进一步评价ANXA7作为胃癌诊断标记物的临床价值，采用ROC曲线进行分析。胃癌患者与正常人ROC曲线的曲线下面积（AUC）为0.941（P＜0.05）（图4）。通过ROC曲线分析得出，取敏感性和特异性之和最高所对应的节点-67.21 ng/L为胃癌患者与正常人的临界值，对胃癌诊断的敏感性为96.59%，特异性为70.15%，阳性预测值为80.95%，阴性预测值为94.00%。

图4 胃癌患者与正常人血清ANXA7水平ROC曲线图Figure 4 The ROC curves of serum ANXA7 levels in gastric cancer patients and healthy subjects

3 讨 论

胃癌在发病初期一般无明显症状或症状轻微、不典型，多数患者就诊时已属晚期，治疗效果差，预后不良[5]。研究特定生物因子在胃癌中表达有助于加深对胃癌发生、发展机制的了解，并有可能为胃癌的早期诊断、合理治疗等提供帮助。ANX超家族广泛分布于动物、植物中，共包括A、B、C、D、E 5个家族，是一类钙离子依赖的磷脂结合蛋白超家族[6]。在脊椎动物细胞中表达的ANX为ANXA家族，共有12个成员，分别为ANXA1～A11和A13。它们都参与了细胞骨架结构活动、细胞的胞饮和胞吐、细胞膜受体构象和功能的调节、细胞膜离子通道的调控、细胞信号调控及细胞分裂、增殖、分化、凋亡等重要功能[2,7-11]。ANXA7是由20世纪70年代从牛的肾上腺髓质内部分离并纯化出的一种蛋白质[12]。人类ANXA7基因位于染色体10q21，编码两种分子量分别为47 kD和51 kD亚型。在心脏和脑中两种亚型同时表达，而在其他组织中只有47 kD的亚型表达[13-14]。ANXA7与细胞的生长、分化、增殖及凋亡等环节密切相关[3,15-16]。

许多研究发现ANXA7在多种肿瘤组织中的表达出现异常，在肿瘤的发生发展中扮演着重要的角色[17-18]。ANXA7在恶性胶质瘤[19]、多形性胶质母细胞瘤[20]、黑色素瘤[21]及前列腺癌[22]中表达下调，起抑癌基因的作用；在肝癌[18]、胃癌[4]、鼻咽癌[23]、结直肠癌[24]、宫颈鳞癌[25]和乳腺癌[26]中表达上调，起癌基因作用。龚晓林等[27]研究ANXA7在胃癌中的表达时发现ANXA7蛋白产物定位于细胞核或胞浆，呈棕黄色颗粒或线网状分布，25.0%的正常胃黏膜标本中ANXA7有低水平的表达，在胃癌原发灶中阳性表达率约占53.3%，差异有统计学意义。袁虎方等[28]通过免疫组化染色法及Western blot法检测了ANXA7在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达，结果表明胃癌组织中ANXA7的表达明显较癌旁正常组织增高。本研究通过qRTPCR及Western blot法检测胃癌组织和配对癌旁正常组织中ANXA7的表达量，结果显示胃癌组织中ANXA7 mRNA和蛋白的表达量均高于癌旁正常组织，与上述研究结果一致。龚晓林等[27]和奚剑敏等[29]采用免疫组化法检测ANXA7蛋白的表达，研究ANXA7表达与临床病理特征之间关系，发现ANXA7在转移癌组织、胃癌组织、胃炎组织中表达逐渐增高，提示ANXA7的低表达与胃癌发生及转移有关；ANXA7表达与腺癌分化程度、淋巴结转移、远处转移和临床分期相关，而与年龄、性别无关。ANXA7可能成为胃癌分化和胃癌转移的判断指标。本研究发现ANXA7的表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、病理类型无关，与肿瘤组织分化程度、浸润深度及有无淋巴结转移相关，与以上结果相近。

为进一步验证ANXA7在胃癌诊断中的临床价值，为临床筛选一种新的胃癌标记物，本研究应用ELISA检测105例胃癌患者及同期体检的50例正常人血清中ANXA7水平，发现胃癌患者外周血ANXA7水平明显高于正常对照组；胃癌组与正常人组ROC曲线的AUC为0.941，表明应用ELISA试剂盒检测外周血中ANXA7可以对胃癌诊断起到很好的效果；以67.21 ng/L为临界值对胃癌诊断的敏感性为96.59%，特异性为70.15%，阳性预测值为80.95%，阴性预测值为94.00%。并且血清ANXA7与组织ANXA7表达情况呈正相关。ANXA7在健康人体内低表达，在癌变细胞中高表达，随之释放入血引起血清水平上升。由此可以推断胃癌肿瘤组织恶性程度越高，增殖活性越大，ANXA7合成越多，就可能有大量的ANXA7释放入血，可以通过检测血清中ANXA7的含量来了解组织中的表达情况。将胃癌患者血清中ANXA7水平与胃癌临床病理因素进行分析，结果显示其在性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、病理类型等方面差异均无统计学意义；在不同分化程度、不同临床分期、有无淋巴结转移的胃癌中差异有统计学意义。此结论与胃癌组织中ANXA7与临床病理因素的关系一致。付刚[30]采用ELISA法测定受检者血清ANXA7水平，结果显示胃癌患者血清ANXA7水平高于良性胃部病变组及健康体检组，表明ANXA7水平与胃癌的发生发展密切相关，在胃癌中ANXA7呈高表达，且与肿瘤分化程度有一定的关联，可作为临床早期诊断胃癌的指标；此外晚期且淋巴结有转移的胃癌患者血清ANXA7水平高于早期、淋巴无转移患者，表明血清ANXA7水平与肿瘤的分期以及分化程度密切相关，ANXA7有望成为临床评估胃癌患者预后的指标。王静等[31]采用ELISA法测定胃癌患者与健康体检者血清ANXA7水平，亦发现胃癌组ANXA7水平显著增高，胃癌患者的年龄、性别以及胃癌的大小、位置对ANXA7水平的影响差异无统计学意义，不同分化程度、TNM分期、淋巴结转移的ANXA7水平差异有统计学意义，此结果同样说明ANXA7与胃癌的分化、临床分期及淋巴转移联系密切，对胃癌患者的预后有重要评价作用。与本研究结论一致。由此可以推测ANXA7在胃癌发生发展过程中发挥着重要作用，在胃癌细胞中ANXA7可能起着原癌基因的作用，促进肿瘤进展。

综上，ANXA7在胃癌组织中呈高表达，其表达水平与胃癌的恶性程度与进展密切相关，血清ANXA7有可能成为胃癌的新型标志物，其临床应用价值，值得进一步深入研究。