茶叶农药残留检测分析方法研究进展

曹春霞 黄大野 吴琼 胡洪涛 朱志刚 龙同 姚经武 杨丹 张光阳

摘要：论述了茶叶农药残留检测的必要性以及茶叶农药残留检测的前处理方法，对固相萃取（SPE）、加速溶剂萃取（ASE）、微波辅助萃取（MAE）、超临界流体萃取（SFE）等萃取方法的原理、应用以及与传统前处理方法相比较的优点进行了概括。也对茶叶农残分析检测方法进行了综述，包括色谱法、酶联免疫法和生物传感器。

关键词：茶叶;农药残留;色谱法;酶联免疫法;生物传感器

中图分类号：X836         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）17-0005-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.17.001           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： The necessity of tea agricultural residue detection and the method of tea pretreatment were discussed. The principle， application and advantages of solid phase extraction （SPE），accelerated solvent extraction （ASE）， microwave assisted extraction of （MAE）， Supercritical fluid extraction （SFE） and other extraction methods compared with the traditional pretreatment methods were summarized.In addition， the detection methods of tea agricultural residues were reviewed， including chromatography， enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and biosensors.

Key words： tea; pesticide residues; chromatography; enzyme-linked immunoassay; biosensors

中國是茶叶生产和出口大国，茶文化源远流长、博大精深。茶叶作为一种传统的饮品，其质量安全直接关系到消费者的健康，是否存在农药残留是其质量安全的重要因素，并且直接影响到茶产业的发展。随着茶园大规模连片种植，病虫害发生的频率越来越高，茶农一般选择化学农药来防治病虫害，存在超量、超范围、盲目用药、安全间隔期短等问题，而长期使用某种农药也会导致茶叶病虫抗药性增强，形成恶性循环。在食品安全和环境保护方面，农药残留污染已成为一个非常严重且必须解决的问题[1]。降低茶叶农药残留有利于促进茶产业转型升级和保障消费者健康。

目前，中国茶叶农药残留检测主要依据农药的种类和特性，采用有机溶剂萃取、固相萃取和凝胶色谱等进行提取净化，并采用液相色谱或气相色谱进行分离检测。因为茶叶成分复杂，采用常规方法处理的提取物往往对农药残留的检测干扰较大，耗时耗材，甚至导致检测器的污染[2]。因此，必须不断创新检测技术，提高农药检测的准确性和效率。目前虽然对茶叶农药残留检测的研究报道越来越多，但相关方面的综述相对较少。本文总结了茶叶农药残留检测的前处理方法和检测技术。

1  茶叶农药残留检测的前处理方法

农药残留检测包括前处理和进样检测，样品的前处理是最关键的环节。为了前处理的高效提取，通常经过3次或多次提取，对于含水量高的样品还需要加无水硫酸钠，对于含糖量高的样品则需要加入适量的水以降低糖浓度。传统的提取方法主要有振荡漂洗法、匀浆萃取法、索氏提取法、液-液萃取法和超声波提取法等，但这些处理方法存在自动化程度低、溶剂消耗量大、处理时间长等缺点[3]。前处理技术发展的趋势是研究开发净化效果理想、时间短、工作强度低的方法，目前前处理技术已经得到了较大的发展，许多技术已经得到广泛应用，如固相萃取（SPE）、加速溶剂萃取（ASE）、微波辅助萃取（MAE）、超临界流体萃取（SFE）等[4]提取技术。

1.1  固相萃取（SPE）

固相萃取（SPE）是应用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，使其与样品的基体和干扰化合物分离，再选择适合的洗脱液把吸附在柱中的组分洗脱下来，达到分离和净化的目的[5]。在层析柱中加入一种或几种吸附剂，再加入待测样本提取液，用淋洗液洗脱，分离保留性质差别很大的化合物。李永库等[6]应用气相色谱法结合固相萃取分离测定了茶叶中11种农药残留，采用ODS-C18固相萃取柱和HLB固相萃取。ODS-C18固相萃取用乙腈作萃取剂进行两次超声提取，试验结果表明ODS-C18固相萃取柱萃取效果比HLB固相萃取好。李敬霞等[7]采用固相萃取柱填料用C18键合相富集柱和色谱固定相HayesepQ（二乙烯基苯聚合物）自装的小柱（100 mg）富集雌激素，也获得了C18键合相富集柱回收率高的结论。由此可见，C18键合相富集柱比色谱固定相HayesepQ（二乙烯基苯聚合物）自装的小柱富集效率高，因而大多数人采用C18键合相富集柱。乙腈极性大、穿透性强，适合多农药残留的提取，因此选择乙腈作为提取剂进行萃取，是农药残留分析中比较通用的前处理提取剂。

1.2  加速溶剂萃取（ASE）

加速溶剂萃取是通过提高温度和增加压力来加快溶解度和扩散率从而提高萃取的效率[8，9]，是近几年较新的萃取技术，具有萃取时间短、溶剂用量少、萃取效率高等优点，是美国EPA的标准方法之一。张桃英[10]采用ASE提取法对茶叶中的六六六、滴滴涕进行提取，回收率在89.6%～108.6%，用ASE法萃取时间大幅度减少，溶剂的使用量也大大降低，提取效果比索氏提取好，萃取多个样品时可实行自动化控制。而茶叶中含有较多的色素、生物碱及酚类化合物等脂溶性物质，在分析中造成干扰，降低分析仪器的灵敏度和使用寿命，孔维恒等[11]采用加速溶剂萃取-凝胶渗透色谱-气相色谱质谱法测定茶叶中7种农药残留，回收率为79.2%～100.8%，相对标准偏差为3.15%～13.34%，该方法萃取效率高、净化效果好、自动化程度高、精密度好，可用于茶叶农药残留的日常检测。黄微等[12]采用加速溶剂萃取（ASE）-固相萃取净化（SPE）-气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）同时测定茶叶中9种拟除虫菊酯类农药残留，ASE萃取溶剂为丙酮-正己烷，检测结果呈现较好的线性关系，背景干扰低、重现性好、灵敏度高、回收率稳定。

1.3  微波辅助萃取（MAE）

微波辅助萃取技术是微波技术与萃取技术的结合，在样品农药残留提取中，利用极性分子能迅速吸收微波能量的性质来加热一些具有极性的溶剤，如乙醇、丙酮、乙腈等，达到萃取样品中目标化合物和分离杂质的目的，具有高效、省溶剂（一般在20～50 mL）、快速节省时间（为传统时间的1/6）、可同时处理多个样品、易于自动控制等优点。颜鸿飞等[13]采用微波辅助萃取-分散固相萃取净化-气相色谱质谱法（GC-MS）快速检测茶叶中23种农药残留量，采用乙腈对茶叶样品进行微波辅助萃取（MAE），提取液经分散固相萃取（DSPE）净化处理，23种农药组分在0.01～0.50 mg/mL质量浓度范围内呈线性关系，相关系数（R）大于0.995，加标平均回收率为70%～105%，相对标准偏差（RSD）为3.0%～8.2%，操作简单、快速、准确、灵敏度高，能够满足中国出口茶叶中多种农药残留检测的实际需要。蔡丽桑等[14]用普通家用变频微波炉萃取茶叶中有机氯农药残留，采用氟罗里硅土柱层析净化方法，以AN-5毛细管柱、GC-ECD的气相色谱法进行检测分析。该萃取方法溶剂使用量少、操作简便快速，效果好，一个样品在2.0～2.5 h可以完成，回收率在90%以上，可满足茶叶中多种农药残留检测的要求。傅杭英[15]建立超声波-酶抑制法前处理分析和微波辅助萃取-酶抑制法检测前处理分析方法，对两种样品前处理技术进行对比研究，结果表明，在相同条件下对茶叶样品中的农药残留进行提取，乙酸乙酯的提取效果最好，提取的样品溶液颜色较浅，回收率最高，以氧化乐果为例，乙腈、乙酸乙酯、丙酮三种溶剂的回收率分别为81.50%、89.21%、79.93%。此外乙酸乙酯的毒性低于乙腈和丙酮，综合考虑，最终选用乙酸乙酯作为提取溶剂。

1.4  超临界流体萃取（SFE）

中国对于超临界流体萃取技术的研究较其他的的样品前处理技术来说发展较早，是目前应用较为广泛的一项样品前处理技术。该技术以超临界流体作为流动相，在高于临界温度和临界压力的条件下，根据相似相溶原理，利用超临界流体的特性，从样品中萃取目标物。主要特点是快速、选择性强，不使用有机溶剂，不污染样品和环境，可以与色谱仪器联用，避免样品转移损失，减少人为误差，提高了方法的灵敏度和精密度，但该技术对设备和技术人员的操作均有较高的要求。邱月明等[16]用超临界流体萃取（SFE）进行样品前处理，用吸附小柱进行富集和净化，气相色谱-电子捕获检测器测定茶叶中17种有机氯农药残留的方法，该法与传统方法有相近的精密度，而分析周期小于2 h，证明此法是一种快速准确的测定茶叶中有机氯农药的方法。

2  茶叶农药残留检测技术

茶叶农残检测的方法包括色谱法、酶联免疫法、生物传感器。色谱法又称色谱分析、色谱分析法、层析法，是一种分离和分析方法，在分析化学、生物化学、有机化学等领域有着广泛的应用。色谱法应用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，从而达到分离的效果。酶联免疫法是指利用抗体与抗原特异性结合的特点，将酶与相应的抗原或抗体结合，酶结合物与相应的抗原或抗体结合后，能通过加入底物的颜色反应来检测免疫反应。生物传感器是一种对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器，具有接受器与转换器的功能，是由固定化的生物敏感材料作识别元件（如微生物、酶、抗体、抗原、细胞等生物活性物质）、适当的理化换能器（如光敏管、氧电极、场效应管等）以及信号放大装置构成的分析工具或系统[17]。

2.1  色谱法

高效液相色谱法与经典的液相色谱法相比具有明显的优势。色谱柱提高了分离效能;高压泵的使用提高了流动相的流速及稳定性;高灵敏度的检测器提高了检测灵敏度;不受试样挥发性和热稳定性影响，可用于分离相对分子质量大、离子型化合物，尤其适用于分析沸点高、热不稳定、不易气化、非挥发性农药的检测。另外与气相色谱法相比，高效液相色谱法的流动相为液体，其组分、配比、pH参与调节待测物在色谱柱内的液固分配机制，更有益于样品的分离分析[18]。陆小磊等[19]采用超高效液相色谱-串联质谱测定茶叶中氯噻啉残留量，用乙腈提取样品，然后经GC-e/NH 2柱去除杂质，经C18液相柱分离后，用电喷雾离子化-串联质谱测定，在12.5～100.0 μg/L质量浓度范围内，氯噻啉工作曲线相关系数（R）为0.994 5，仪器最小检出量为5.98×10-13 g。茶叶中氯噻啉回收率在94.66%～96.30%，相对标准偏差（RSD）小于8.0%，最低检出限为0.99×10-3 mg/kg。该方法准确、快速、稳定，能够满足实际残留检测的需要。

2.2  酶联免疫法

色谱法因具有准确、高效、灵敏等特点而应用较广，但由于样品前处理复杂，且对设备和技术要求较高，不适用于大范围的快速筛选。而免疫分析方法在特异性、灵敏度、操作步骤和材料价格上具有明显的优势，适用于快速筛选及检测，已渐渐成为一种重要的农药残留检测技术[20]。当前用于农药残留分析的免疫分析方法主要有4种，包括酶联免疫吸附分析（EIA/ELISA）、放射免疫分析（RIA）、荧光免疫分析（FIA/PFIA）、化学发光免疫分析（CLIA）。其中，EIA/ELISA是较常用的农药残留检测方法，是将免疫技术和现代化测试技术进行融合后产生的新型技术形式，涉及到多个学科知识的综合应用，为农药残留检测技术的发展创新提供了更加广阔的思路[21]。方松等[22]建立了基于多克隆抗体的氯噻啉间接竞争酶联免疫分析（ic-ELISA）方法。设计合成了氯噻啉半抗原，并分别与牛血清蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联制备免疫原和包被原。用免疫原免疫新西兰大白兔制備多克隆抗体，抗体效价为2.56×106。对离子强度、有机溶剂含量和pH等影响因素进行优化，确定了氯噻啉ic-ELISA的最佳检测条件，并建立了氯噻啉标准竞争曲线，该方法的抑制中浓度（IC50）为0.18 mg/L，最低检测限（IC10）为0.001 8 mg/L，在水、土壤和甘蓝中分别添加0.05～1.00 mg/kg 的氯噻啉标准溶液，平均回收率为91.42%～113.82%，相对标准偏差（RSD）为0.72%～8.68%，符合农药残留检测要求。由于食品中较多情况下存在多种农药残留，单农药组分免疫分析方法及检测试剂盒很难满足实际需要。因此，开发具有宽谱特异性的抗体来制备多残留检测试剂盒更能适应科学研究和市场需求。

2.3  生物传感器

生物体成分（抗原、抗体、酶、激素、DNA）或生物体本身（组织、细胞、细胞器）能特异地识别被测物质并与之反应;后者主要有电化学电极、离子敏场效应晶体管（ISFET）、热敏电阻器、光纤、光电管等，其功能是将敏感元件感知的生物化学信号转变为可测量的电信号。根据生物活性物质不同，生物传感器可分为酶传感器、微生物传感器、免疫传感器等。农药残留检测领域中应用最广泛的是酶传感器和微生物传感器。

酶传感器是将酶经过某种方式与固相载体结合，并将其装在一个小柱子中成为固定化反应柱，或将酶固定在电极上采用电化学的方式传导酶反应产物的信息。按照反应原理和敏感材料可分为酶抑制生物传感器、酶联免疫生物传感器、酶降解生物传感器等，其中酶抑制生物传感器在农药残留检测中研究较为广泛。目前结合电学或光学转换器形成一系列的电化学、光化学酶抑制生物传感器，实现了蔬菜、水果、土壤和水中的有机磷、氨基甲酸酯类农药残留快速检测。梁东军等[23]应用自组装法制备了多层乙酰胆碱酯酶/壳聚糖/碳纳米管（AChE/CS/FCNTs/GCE）生物传感器，该传感器对氨基甲酸酯类农药具有较好的响应，如2-（1-甲基乙基）苯基甲基氨基甲酸酯在2.00×10-9～2.00×10-7 g/L内呈现良好的线性关系，检出限为5.41×10-9 g/L。干宁等[24]将乙酸胆碱酯酶（AChE）及胆碱氧化酶（ChOx）同时固定在丝网印刷电极表面的Fe3O4/Au纳米复合微粒上， 构建了一种新型快速测定有机磷和氨基甲酸酯类农药的双酶传感器，该传感器对克百威和敌敌畏的检测范围在0.05～1.00 μg/mL，成本较低、制备简单，适用于氨基甲酸酯和有机磷类农药现场大规模筛测。

微生物传感器的检测原理分为两种：一种是利用微生物在同化底物时消耗氧的呼吸作用;另一种是利用不同微生物含有的酶不同，这和动植物组织一样，把它作为酶源。在微生物数量和活性不变的情况下，根据其消耗的溶解氧量或产生的电活性物质的量来反映检测物质的量，然后借助气体敏感膜电极（如二氧化碳电极、溶解氧电极、氨电极等）或离子选择电极（如pH玻璃电极）来检测溶解氧和电活性物质的变化，即可求出待测物质的量。袁东星等[25]研究了一种快速检测蔬菜中有机磷农药残留的方法，采用一种发光细菌与盐溶液相结合，从蔬菜中洗涤出残留的农药，加入定量发光菌溶液，通过观察发光量的变化来检测农药含量。结果表明，此方法可检测蔬菜中有机磷农药残留，成本低廉且快速有效。

3  展望

当前，茶叶农药残留检测的前处理技术朝着更方便、更高效、检测成分多元化等方向发展。随着检测技术和设备的发展，样品的提取技术也会相应进步。检测技术向样品与试剂微量化、高灵敏度、高精准度、前处理与检测一体化的趋势发展。

茶叶产业是目前精准扶贫和农业供给侧改革的重要抓手，加强茶叶质量安全管理对提高中国茶叶产业的生产水平，增强中国茶叶产品的国际竞争力具有十分重要的战略意义。

输欧茶叶因其利润高，受到国内出口茶企的青睐和重视，已成为出口转型升级的主攻方向之一。随着农业部实施“两减行动”和“十三五”重点研发计划，中国茶叶种植基地对化学农药的使用有着较高的认识，逐渐采用生物农药替代化学农药，达到从源头控制农残的目的。但是当前农药生产流通环节仍然比较混乱，一药多名、一名多药的现象普遍存在，一些茶叶种植过程禁用的农药如氰戊菊酯、三氯杀螨醇、氟虫腈等在农药流通市场仍可采购或混配在其他农药产品中，还有部分产品打着生物农药的名头却添加化学农药等隐性成分，造成农药残留超标，这些都给茶叶农药残留问题留下了极大隐患。

近几年，欧盟对中国输欧茶叶农药残留检测要求日趋严格，口岸管控措施也日渐加严，使得出口欧盟茶叶面临极其严峻的形势。科研机构应当加快低毒、环境友好型病虫害防控新技术的研发，结合预测预报，推广化学农药、生物农药的配套使用等技术措施。地方政府应严格控制农药的使用特别是禁用高毒农药，加强流通环节农药质量监管，建立涉茶农药档案，保障茶叶质量安全。

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收稿日期：2019-04-19

基金项目：湖北省技术创新专项（2017ABA160）;湖北省农业科技创新中心创新团队项目（2016-620-000-001-038）

作者简介：曹春霞（1975-），女，湖北武汉人，研究员，主要从事生物农药剂型与应用技术研究及生物农药示范推广，（电话）13971093916