热休克蛋白A5对雨蛙肽诱导的胰腺腺泡细胞损伤的作用研究

胰腺炎是一种病因较复杂的临床常见疾病，可分为急性胰腺炎和慢性胰腺炎[1-2]。急性胰腺炎的病情较严重，可引起全身并发症，出现多功能器官衰竭，甚至危及生命[3]。Lerch等[4]早在1992年已发现急性胰腺炎的早期损伤部位是胰腺腺泡细胞。在胰腺炎动物模型中，消化酶和溶酶体水解酶的转运出现障碍，且均出现在细胞内的液泡中[5]。随着细胞生物学和分子生物学的发展，学者们对腺泡细胞损伤机制的认识不断深入，这对研究胰腺炎的发病机制具有重要意义。

热休克蛋白A5(HSPA5)是HSP 70家族成员之一，其可作为分子伴侣促进正常生长状态下的细胞蛋白质成熟，是维持细胞机能和生命的关键性调节物[6]。HSPA5可识别错误折叠的多肽，并通过蛋白酶作用使其降解，其也是内质网上的一种应激蛋白，在低糖、低氧或缺钙的应激状态下大量表达以维持内质网稳定，保护细胞对抗生理变化损伤[7]。HSPA5不仅在早期胚胎发育时是高度激活的，也是低葡萄糖水平、低pH和低氧诱导的结果，而这种环境非常有利于肿瘤的生长[8]。总之，HSPA5可通过阻断细胞重要蛋白质的变性及聚合而达到保护细胞的作用。HSPA5在多种肿瘤中均高表达，为促癌因子[9]，但其在胰腺腺泡细胞中的作用机制尚未阐明。

雨蛙肽是一类与胆囊收缩素化学结构和药理作用相似的多肽类物质，具有较强的刺激胆囊收缩和胰酶分泌的作用。雨蛙肽可引起胰酶异常激活、凋亡基因表达、钙通道调控失调等，从而诱导胰腺腺泡细胞凋亡，引发组织损伤[10]。这也为体外诱导胰腺腺泡细胞损伤，研究胰腺炎起到了重要作用。

本研究将建立雨蛙肽诱导的胰腺腺泡细胞损伤模型，通过检测HSPA5的mRNA和蛋白表达，观察过表达HSPA5和敲除HSPA5对胰腺腺泡细胞淀粉酶活性、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率以及细胞增殖和凋亡的影响，以明确HSPA5对雨蛙肽诱导的胰腺腺泡细胞损伤的作用，以期为胰腺炎的早期诊断和治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

胰腺腺泡细胞AR42J购自美国模式培养物保藏所(CRL-1492TM)；胎牛血清、DMEM培养液、雨蛙素、MTT、SDS-PAGE 试剂、胰蛋白酶、ECL发光液和RIPA蛋白裂解液均购自碧云天生物技术公司；PVDF膜购自德国罗氏诊断有限公司；Biovision淀粉酶活性检测试剂盒、LDH细胞毒性检测试剂盒均购自武汉艾美捷科技有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自成都艾为特生物科技有限公司；LipofectamineTM2000脂质体试剂盒购自上海基星生物公司；BCA蛋白定量试剂盒购自美国HyClone Pierce公司；逆转录试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；凝胶成像分析仪购自美国Kodak公司；半干转膜仪和PCR 仪购自美国BIO-RAD公司；流式细胞仪购自美国 FALS CALIBAR BD公司；ABI 7500型实时荧光定量PCR系统购自美国ABI公司；紫外分光光度计购自美国Thermo公司；细胞培养箱购自美国Forma Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养胰腺腺泡细胞AR42J，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h，然后进行换液培养传代。

1.2.2 转染 为建立雨蛙肽诱导的胰腺腺泡细胞损伤模型，将正常培养的胰腺腺泡细胞AR42J标记为对照组，将分别用高浓度和低浓度的雨蛙肽(1×10-5mol/L、1×10-11mol/L)处理48 h的AR42J细胞标记为Cer-H组、Cer-L组；为检测HSPA5对胰腺腺泡细胞损伤的影响，将pcDNA3.1-HSPA5、pcDNA3.1、shHSPA5、shCon用LipofectamineTM2000脂质体试剂盒分别转染至AR42J细胞，转染6 h后，更换新鲜培养基继续培养48 h，用qRT-PCR法确认转染成功后，将其标记为pcDNA3.1-HSPA5组、pcDNA3.1组、shHSPA5组、shCon组，将不做任何处理的AR42J细胞标记为阴性对照组；为了检测过表达HSPA5对雨蛙素诱导的胰腺腺泡细胞损伤的影响，分别将pcDNA3.1-HSPA5和pcDNA 3.1用同样的脂质体方法转染至Cer-H组细胞，转染6 h后，更换新鲜培养基再次培养48 h，用qRT-PCR法检测转染是否成功，将转染成功的标记为pcDNA 3.1+Cer-H组、pcDNA 3.1-HSPA5+Cer-H组，不做任何处理的AR42J细胞标记为正常对照组。取对数生长期的转染细胞进行淀粉酶活性、LDH漏出率、qRT-PCR、Western blot和流式细胞术检测。

1.2.3 淀粉酶活性测定 取适量对数生长期的胰腺腺泡细胞，按照淀粉酶活性检测试剂盒说明书操作，在405 nm波长下测定细胞的吸光度。细胞中淀粉酶活性与细胞吸光度呈正比。每个样品做5个重复孔，实验重复3次。

1.2.4 LDH漏出率测定 取适量胰腺腺泡细胞，按照LDH细胞毒性检测试剂盒说明书操作，在490 nm波长下测定LDH的吸光度。LDH活性与LDH吸光度呈正比，与LDH漏出率呈反比。漏出率(%)=检测组LDH OD490/对照组LDH OD490×100 %。每个样品做5个重复孔，实验重复3次。

1.2.5 qRT-PCR检测HSPA5 mRNA表达 取适量对数生长期细胞，用Trizol法裂解细胞，RNA抽提试剂盒提取RNA并定量。用逆转录试剂盒合成cDNA，用qRT-PCR试剂盒检测HSPA5 mRNA表达，以2-△△Ct法计算定量结果。实验重复3次。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡率 取适量对数生长期细胞，用预冷的PBS洗涤2次。用结合缓冲液500 μL悬浮细胞，分别加入5 μL的 Annexin V-FITC和PI，混匀，室温避光静置15 min。采用流式细胞仪分析测定细胞凋亡率。细胞总凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。每个样品重复3次。

1.2.7 Western blot检测HSPA5蛋白表达 取对数生长期细胞，RIPA裂解后用BCA试剂盒定量，在100 ℃水中变性10 min，离心后取上清进行蛋白上样。按照Western blot操作流程进行电泳-转膜-封闭-Ⅰ抗孵育-Ⅱ抗孵育-显影曝光。Image J软件分析目的条带灰度值，以目的条带灰度值与Actin灰度值的比值表示目的蛋白的表达情况。

2 结果

2.1 不同浓度的雨蛙肽对胰腺腺泡细胞的损伤

如图1A、1B所示，与对照组相比，高浓度和低浓度雨蛙肽处理的胰腺腺泡细胞的淀粉酶活性、LDH漏出率均显著升高，差异均有统计学意义(P<0.01)。用MTT法检测高浓度和低浓度雨蛙肽处理的胰腺腺泡细胞存活率，结果如图1C所示，与对照组相比，Cer-L组和Cer-H组胰腺腺泡细胞的存活率均显著降低。用流式细胞术检测细胞凋亡率，结果如图1D所示，与对照组相比，Cer-L组和Cer-H组胰腺腺泡细胞的凋亡率均显著升高，差异均有统计学意义(P<0.01)。可见，不同浓度的雨蛙肽均可造成胰腺腺泡细胞损伤，本研究选用高浓度雨蛙肽用于后续胰腺腺泡细胞损伤模型的制备。

2.2 HSPA5在雨蛙肽损伤的胰腺腺泡细胞中的表达

与对照组相比，Cer-L组和Cer-H组细胞中HSPA5 mRNA的表达水平均显著升高(图2A)，HSPA5的蛋白表达水平均显著升高(图2B、2C)，差异均有统计学意义(P<0.01)。结果显示HSPA5在雨蛙肽损伤的胰腺腺泡细胞中高表达。

注：与对照组相比，**P<0.01

图1不同浓度雨蛙肽对各组胰腺腺泡细胞损伤的影响A各组细胞淀粉酶活性比较B各组细胞LDH漏出率比较C各组细胞存活率比较D各组细胞凋亡率比较

注：与对照组相比，**P<0.01

图2雨蛙肽损伤的胰腺腺泡细胞中HSPA5的表达A各组细胞中HSPA5 mRNA表达的比较B各组细胞中HSPA5蛋白表达的比较(电泳图)C各组细胞中HSPA5蛋白表达的比较(柱状图)

2.3 过表达HSPA5对胰腺腺泡细胞损伤的影响

将pcDNA3.1-HSPA5、pcDNA3.1以脂质体法分别转染到胰腺腺泡细胞，转染48 h后，用Western blot检测HSPA5蛋白的表达，结果如图3A、3B所示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-HSPA5组细胞中HSPA5蛋白表达显著升高。如图3C、3D所示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-HSPA5组细胞淀粉酶活性、LDH漏出率均显著下降，差异均有统计学意义(P均<0.01)。结果显示过表达HSPA5可保护胰腺腺泡细胞。

2.4 敲减HSPA5对胰腺腺泡细胞损伤的影响

将shCon、shHSPA5用脂质体法分别转染至胰腺腺泡细胞，标记为shCon组、shHSPA5组，以观察敲减HSPA5对胰腺腺泡细胞损伤的影响。与shCon组相比，shHSPA5组细胞中HSPA5蛋白表达水平显著降低(图4A)，淀粉酶活性显著升高(图4B)，LDH漏出率显著升高(图4C)，差异均有统计学意义(P均<0.01)。结果显示敲减HSPA5可加重胰腺腺泡细胞的损伤。

2.5 过表达HSPA5对雨蛙肽对胰腺腺泡细胞损伤作用的影响

分别将pcDNA3.1、pcDNA3.1-HSPA5用脂质体法转染至用高浓度雨蛙肽处理的胰腺腺泡细胞，标记为pcDNA3.1+Cer-H组、pcDNA3.1-HSPA5+Cer-H组，用来观察过表达HSPA5对雨蛙素损伤胰腺腺泡细胞的影响。与正常对照组相比，pcDNA 3.1+Cer-H组细胞淀粉酶活性、LDH漏出率、细胞凋亡率均显著升高，细胞存活率显著降低，差异均有统计学意义(P均<0.01)；正常对照组与pcDNA 3.1-HSPA5+Cer-H组细胞淀粉酶活性、LDH漏出率、细胞存活率、细胞凋亡率的差异均无统计学意义。见图5。结果显示过表达HSPA5可减轻雨蛙肽对胰腺腺泡细胞的损伤作用。

注：与pcDNA3.1组相比，**P<0.01

图3过表达HSPA5对胰腺腺泡细胞损伤的影响A各组细胞中HSPA5蛋白表达的比较(电泳图)B各组细胞中HSPA5蛋白表达的比较(柱状图)C各组细胞淀粉酶活性比较D各组细胞LDH漏出率比较

注：与shCon组相比，**P<0.01

图4敲减HSPA5对胰腺腺泡细胞损伤的影响A各组细胞中HSPA5蛋白表达的比较B各组细胞淀粉酶活性比较C各组细胞LDH漏出率比较

注：与正常对照组组相比，**P<0.01

图5过表达HSPA5对雨蛙肽对胰腺腺泡细胞的损伤A各组细胞淀粉酶活性比较B各组细胞LDH漏出率比较C各组细胞存活率比较D各组细胞凋亡率比较

3 讨论

雨蛙肽又名雨蛙素、蛙皮素、羚蟾素、羚蟾肽，目前已开发用于建立大鼠、小鼠、狗和叙利亚仓鼠等急性胰腺炎动物模型，1971年首次由Anastasi等[11]从欧洲两种蛙的皮肤中提取所得，它是一个具有多种活性结构形式的家族，其结构为10～27个氨基酸，雨蛙肽为14肽，均具有与雨蛙肽相似的C端肽链，而且具有许多相同的生理作用[12]。许多研究报道应用雨蛙肽建立胰腺炎模型[13-15]。本研究用不同浓度的雨蛙肽与胰腺腺泡细胞共培养，通过试剂盒检测细胞淀粉酶活性和LDH漏出率，MTT法检测细胞存活率，流式细胞术检测细胞凋亡率，结果显示不同浓度的雨蛙肽均可造成胰腺腺泡细胞损伤。

1962年Ritossa[16]首次发现热休克现象，1974年有学者将在热休克中发生抑制的蛋白命名为“HSP”。HSP中较保守和较主要的成员有HSP68、HSP70、HSP72和HSP78，其中HSP70及其编码基因均具有高度保守性，其在缺血性脑损伤中的研究较多[17]。HSP70是目前哺乳动物细胞中重要的、研究得较为深入的HSP家族，HSPA5为HSP70家族中的一员，其具有HSP70的特性和功能。尽管HSPA5在很多肿瘤组织和肿瘤细胞中高表达，且具有促进肿瘤发生、发展的作用，但HSP70的这种普遍存在、高度保守的特性是细胞保护的基础，得到了广泛认可[18-20]。于枫等[21]对HSP70与细胞凋亡的关系的研究发现，HSP70可阻止变性细胞蛋白质凝集，调节应激活化蛋白激酶，阻止细胞色素C从线粒体释放，抑制细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子1 结合，阻止半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)活化，从而抑制细胞凋亡，保护细胞受损。

本研究建立了雨蛙肽刺激AR42J细胞的胰腺炎模型，通过qRT-PCR和Western blot检测受损的AR42J细胞中HSPA5的mRNA和蛋白表达，发现HSPA5在受损的AR42J细胞中高表达；此外，通过检测敲减和过表达HSPA5的AR42J细胞的淀粉酶活性、LDH漏出率、细胞存活率及细胞凋亡率，发现HSPA5对受损的AR42J细胞具有修复能力，揭示其对雨蛙肽诱导的胰腺腺泡细胞损伤具有保护作用。

综上所述，HSPA5可保护雨蛙肽诱导的胰腺腺泡细胞损伤，这对急性胰腺炎的靶点治疗具有重要意义。