慢病毒介导miR-215过表达对克罗恩病的影响及作用机制

克罗恩病(CD)以非特异性的炎性损伤、肉芽肿、结肠局灶性为主要病变特征[1]。CD患者通常有腹痛、腹泻、便血等症状，严重影响患者的生活质量[2]。有研究发现，miR-215的上调与自噬等信号通路相关[3]。自噬参与了CD的炎性反应和组织损伤，抑制自噬有助于缓解CD症状[4-5]。因此推测，miR-215可能通过调节自噬对CD起到缓解作用。本研究通过2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导建立小鼠CD模型，探究miR-215在CD中的作用及对自噬的调控作用。

1 材料

1.1 实验动物

48只BALB/c小鼠，SPF级，体质量为(20±2)g，6～8周龄，由北京军事科学院实验动物中心提供。实验小鼠置于温度为(21±2)℃、湿度为(55±10)%、12 h/12 h明暗周期的环境中，保证每只实验小鼠可以自由地接触水源和食物。

1.2 试剂与仪器

试剂：TNSB(美国Sigma公司)，白细胞介素-8(IL-8)、IL-10、ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)，基因组DNA提取试剂盒(日本TaKaRa公司)，AMV逆转录酶试剂盒(日本TaKaRa公司)，SYBR Green(美国Amibion公司)，Lenti-miR-215(上海吉玛公司)，HE染色试剂盒(武汉博士德公司)，Beclin1多克隆抗体、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)多克隆抗体、IL-1β多克隆抗体(美国Santa Cruz生物技术公司)，髓过氧化物酶(MPO)检测试剂盒(南京建成科技有限公司)。

仪器：酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)，PCR仪(美国Bio-Rad公司)，水平电泳槽(北京六一仪器厂)，电泳仪(北京六一仪器厂)，低温高速离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

2 方法

2.1 造模与分组

选取48只小鼠，予以禁食不禁水12 h，乙醚麻醉，随机分成两组，空白组(A组)和模型组，A组12只灌肠给予50%的乙醇溶液100 μL，模型组36只肛门注入浓度为2.5%的TNBS乙醇溶液100 μL，注射完毕后倒提小鼠30 s防止液体流出。造模后每日观察小鼠的体质量、排便情况、进食情况以及精神状态[6]。3 d后，空白组随机选取2只，模型组随机选取6只处死，取结肠组织进行病理学观察，判断TNBS诱导的小鼠CD模型构建成功与否。将造模成功的30只小鼠随机分成3组，设为TNBS组(B组)、Lenti-Scramble(C组)和Lenti-miR-215(D组)，每组各10只。A组灌肠给予100 μL生理盐水，B组灌肠给予100 μL生理盐水，C组灌肠给予100 μL慢病毒载体，D组灌肠给予100 μL表达miR-215的慢病毒载体。连续灌肠2周，每周2次。

2.2 小鼠疾病活动度的评价方法

小鼠疾病活动指数(DAI)评估：每日观察小鼠的体质量和粪便，行粪便潜血实验。根据表1进行DAI评分。DAI=(体质量下降分数+粪便性状分数+便血分数)/3，体质量减失率(%)=(实验前体质量-造模后体质量)/实验前体质量×100%[7]。

表1 小鼠DAI评分

2.3 ELISA法检测血清IL-8、IL-10、MPO的水平

入组小鼠麻醉后下腔静脉取血，室温静置2 h，3 000 r/min离心10 min，取上层血清。采用ELISA法检测血清中IL-8和IL-10、MPO水平，实验操作过程严格按照说明书进行。

2.4 HE染色检测结肠组织病理改变

将在多聚甲醛中固定过的结肠组织制作成4 μm厚的石蜡切片，进行HE染色，观察结肠组织病理学改变。

2.5 Real-time PCR检测结肠组织内miR-215 mRNA和Beclin1 mRNA的表达

用Trizol试剂提取结肠组织内的总RNA，逆转录合成cDNA，以cDNA为模版进行PCR扩增，各基因的引物序列见表2，反应体系10 μL，反应条件为95 ℃ 预变性10 min，随后95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，循环40次。采用2-ΔΔCt法计算结果。

表2 引物序列

2.6 Western blotting检测结肠组织内Beclin1蛋白、TNF-α和IL-1β蛋白的表达

使用含PMSF的RIPA裂解液制备蛋白样品，BCA试剂盒检测蛋白浓度，上样。60 V电泳30 min，80 V电泳90 min，横流200 mA转膜100 min。转膜完毕后5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗(1∶1 000)4 ℃过夜，PBST洗3次，每次10 min，二抗(1∶4 000)室温孵育1 h，然后再用PBST洗3遍，然后加入ECL发光液进行曝光显影。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 各组小鼠DAI评分比较

A组、B组、C组、D组DAI评分分别为0.25±0.12、3.52±0.55、3.34±0.67、1.55±0.32，四组间相比较，差异具有统计学意义(F=185.30，P<0.001)。B组、C组、D组DAI评分高于A组，差异具有统计学意义(P<0.05)。与B组相比，C组DAI评分没有显著性差异(P>0.05)，D组DAI评分显著降低(P<0.05)。与C组相比，D组DAI评分显著降低(P<0.05)。

3.2 各组小鼠结肠组织学观察

由图1可知，A组结肠黏膜结构完整，分层清晰，上皮细胞排列紧密，杯状细胞连续分布，腺管结构完整，固有层没有炎性细胞浸润。B组结肠组织上皮细胞数量减少，腺体缺失，黏膜层破坏严重，炎性细胞大量浸润黏膜固有层。C组结肠组织表现出与B组类似的炎性症状。D组结肠组织切片与A组类似，结肠组织细胞排列紧密，结构完整，层次清晰。

图1各组小鼠结肠组织学观察 HE ×200A空白组的结肠组织BTNBS组的结肠组织CLenti-Scramble组的结肠组织DLenti-miR-215组的结肠组织

3.3 各组小鼠结肠组织IL-8、IL-10和MPO水平比较

A组、B组、C组、D组结肠组织IL-8、IL-10和MPO水平比较，差异均具有统计学意义(F=25.64、7.25、21.14，P<0.001)。与A组相比，B组、C组结肠组织IL-8、MPO水平均升高而IL-10水平降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与B组相比，C组结肠组织IL-8、MPO、IL-10水平的差异无统计学意义(P>0.05)，D组结肠组织IL-8、MPO水平均显著降低，IL-10水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与C组相比，D组结肠组织IL-8、MPO水平显著降低而IL-10水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

3.4 各组小鼠结肠组织miR-215 mRNA和Beclin1 mRNA表达水平的比较

A组、B组、C组、D组结肠组织miR-215和Beclin1 mRNA表达水平比较，差异均具有统计学意义(F=39.73、7.25、21.14，P<0.001)。与A组相比，B组、C组、D组结肠组织miR-215 mRNA表达水平降低，B组、C组Beclin1 mRNA表达水平降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与B组相比，C组结肠组织miR-215、Beclin1 mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，D组结肠组织miR-215、Beclin1 mRNA表达水平均显著升高(P<0.05)。与C组相比，D组结肠组织miR-215、Beclin1 mRNA表达水平均显著升高(P<0.05)。见表4。

表3 各组小鼠结肠组织IL-8、IL-10和MPO水平的比较()

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05；与C组比较，cP<0.05

表4 各组小鼠结肠组织miR-215 mRNA和Beclin1 mRNA表达水平的比较()

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05；与C组比较，cP<0.05

3.5 各组小鼠结肠组织Beclin1蛋白、TNF-α蛋白和IL-1β蛋白表达水平的比较

A组、B组、C组、D组结肠组织Beclin1蛋白、TNF-α蛋白和IL-1β蛋白表达水平比较，差异均具有统计学意义(F=11.36、26.73、21.14，P<0.001)。与A组相比，B组、C组结肠组织Beclin1蛋白表达水平降低，TNF-α、IL-1β蛋白表达水平均升高，D组TNF-α、IL-1β蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义(P均>0.05)。与B组相比，C组结肠组织Beclin1、TNF-α、IL-1β蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，D组结肠组织Beclin1蛋白表达水平显著升高，同时TNF-α、IL-1β蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与C组相比，D组结肠组织Beclin1蛋白表达水平显著升高，TNF-α、IL-1β蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见表5、图2。

图2 各组小鼠结肠组织Beclin1蛋白、 TNF-α蛋白和IL-1β蛋白的表达表5 各组小鼠结肠组织Beclin1、TNF-α和 IL-1β蛋白表达水平的比较()

组别例数Beclin1TNF-αIL-1βA组100.42±0.120.16±0.140.16±0.07B组100.20±0.09a0.69±0.13a0.71±0.16aC组100.17±0.05a0.75±0.15a0.76±0.23aD组100.33±0.06bc0.40±0.09abc0.41±0.17abc

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05；与C组比较，cP<0.05

4 讨论

炎症性肠病(IBD)包括溃疡性结肠炎(UC)和CD两种类型。CD是一种慢性的胃肠道肉芽肿炎性反应，其发病率在发达国家较高，在中国则呈逐年升高趋势[8-9]。有研究表明，miR-215可能是预测CD的生物学标志物[10]，但是miR-215在CD中的作用机制仍待探究。

为了研究miR-215对CD的影响，本实验首先采用TNBS建立小鼠CD模型。小鼠DAI评分结果显示，与A组相比，B组小鼠DAI评分显著升高，结肠组织HE染色显示上皮细胞数量减少，腺体缺失，黏膜层破坏严重，炎性细胞大量浸润黏膜固有层，促炎因子IL-1β、IL-8和TNF-α水平显著升高，而抗炎因子IL-10水平显著降低，表明CD模型构建成功。通过比较正常小鼠和CD小鼠结肠组织中miR-215的水平，发现CD小鼠中miR-215的表达水平显著降低，表明miR-215可能参与CD的发展。为了进一步研究miR-215对CD的影响，本实验通过灌肠给予CD小鼠表达miR-215的腺病毒载体后，发现miR-215的高表达可以显著降低小鼠的DAI评分，并且显著改善结肠组织的病理学改变，同时会使促炎因子IL-1β、IL-8和TNF-α水平显著降低，抗炎因子IL-10水平显著升高，表明miR-215确实与CD存在密切的联系。

Beclin1也称Atg6，是哺乳动物中首个被发现的可以调节自噬的基因，是启动自噬发生的一个重要开关[11]。有研究发现，Atg16L1基因敲除会导致肠道炎性反应和肠道上皮细胞发生损伤，自噬基因Atg2A突变也可能与CD的发生有关[12-15]。本研究发现miR-215过表达可以使小鼠结肠组织Beclin1的mRNA和蛋白的表达水平显著升高，表明过表达miR-215可能是通过Beclin1介导的自噬通路发挥改善CD的作用的。Paul等[16]发现，自噬可以减少IL-1β等促炎因子的释放。本研究结果发现，miR-215过表达可以使CD小鼠Beclin1 mRNA及其蛋白水平升高，增加结肠组织自噬的同时，降低促炎因子IL-1β、IL-8和TNF-α的表达水平，并升高抗炎因子IL-10的表达水平，表明自噬水平的升高可以减少相关促炎因子的释放，升高抗炎因子的水平，从而减轻CD过程中的炎性损伤程度。

综上所述，miR-215的过表达对于TNBS诱导的CD具有保护作用，而且该作用与Beclin1介导的自噬通路有关。