藿香内生真菌次级代谢产物抗菌活性研究

马建苹/王 丹/李善家/郭 涛 兰州理工大学生命科学与工程学院，兰州730050

马建苹/王 丹/郭 涛 甘肃省中藏药筛选评价及深加工重点实验室，兰州理工大学，兰州730050

晋 玲 甘肃中医药大学药学院，兰州730000

藿香(Agastache rugosa)为唇形科(Labiatie)藿香属(Agastache)一年生或多年生草本植物，全草可入药，有止呕吐、治霍乱腹痛、驱逐肠胃充气、清暑等效；果可作香料；叶及茎均富含挥发性芳香油，有浓郁的香味，为芳香油原料[1]。藿香挥发油中的主要成分甲基胡椒酚也能够对多种病原菌产生抑制作用[2]。随着植物内生真菌被人们重视，其次级代谢产物中许多具有抗菌活性的单体化合物被报道[3]。植物内生真菌能够产生与宿主植物相似或相同的物质，因此希望从藿香内生真菌次级代谢产物获得具有抗菌活性的物质代替化学合成的抗菌剂。但国内外鲜有藿香内生真菌次级代谢产物抗菌活性的报道。鉴于藿香及其内生真菌的重要价值，本研究希望对藿香内生真菌的次级代谢产物进行抑菌活性研究，筛选出能产生抗菌活性次级代谢产物的菌株，为具有抗菌活性的单体化合物的分离提供活性指导，同时为藿香内生真菌次级代谢产物的开发利用提供理论基础。

1.材料及仪器

1.1 材料与仪器

植物采集于甘肃省兰州市石佛沟，经甘肃中医药大学晋玲教授鉴定为藿香Agastache rugosa。紫外分光光度计、电子分析天平、电热恒温干燥箱、超净工作台、旋转蒸发器、恒温振荡培养箱、实验型高压灭菌锅等均为常用仪器；实验所用药品试剂均为国产分析纯。

1.2 供试菌株

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)均由兰州理工大学生命科学与工程学院实验中心提供。

2.实验方法

2.1 培养基配制

马铃薯葡萄糖培养基(PDB)：取去皮马铃薯200g，加适量水煮沸30min，8层纱布过滤，加入葡萄糖20g，定容至1000mL，121℃灭菌30 min，待冷却后分别加入100U/mL的青霉素和硫酸链霉素各1mL。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：去皮马铃薯200g，煮沸30min，8层纱布过滤，加入葡萄糖20g，定容至1000mL，然后加入1.5 % ～ 2 %琼脂，121℃灭菌30 min，待冷却至50℃左右时，加入100U/mL的青霉素和硫酸链霉素各1mL。

MH肉汤：蛋白胨1%，氯化钠0.5%，牛肉膏0.3%，加蒸馏水并加热使其充分溶解后，用1M的氢氧化钠溶液调节pH值至7.2 ～ 7.4，放入高压灭菌锅内，101 kPa，121℃灭菌30 min，放入4℃冰箱，备用。

2.2 内生真菌的分离与鉴定

组织分离法：取干燥洗净的藿香花，用解剖刀将其切成0.5cm×0.5cm×0.5cm小块。在无菌条件下先后用75 % (V/V)乙醇(1 min)、0.1 %升汞(2 min)消毒，消毒后用无菌水反复冲洗3次，用已灭菌的滤纸吸干水分。用已灭菌的镊子将组织块接入到PDA培养基上，以最后1次表面消毒冲洗后的无菌水作为参照，28℃恒温培养7 d。待内生真菌长出后，观察菌落形态特征，重复划线纯化[4]。采用插片法：将已纯化的内生真菌接种到PDA平板上，将已灭菌的盖玻片斜插入平板中，28℃培养，生长完全后放于载玻片上经过棉兰染色后，在光学显微镜下观察菌丝、孢子和分生孢子梗等形态。根据《真菌鉴定手册》初步鉴定[5]。对次级代谢产物具有良好抗菌活性的菌株H-2与H-9进行测序后，将序列在NCBI中BLAST分析对比得出菌株H-2黑孢霉属(Niqrospora sp.)真菌，其登录号为MK894846，菌株H-9为链格孢属(Alternariasp.)真菌，其登录号为MK880492。

2.3 内生真菌的发酵培养及供试样品的制备

挑取已活化的菌株接种于PDB培养液中，28℃、120r/min培养7d，发酵结束后，抽滤，得到滤液与菌丝体。在滤液中先后加入等体积的乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，各萃取3次，合并萃取液，减压蒸干，得到发酵液的乙酸乙酯和正丁醇部位；菌丝体冷冻干燥后用乙醇回流提取2～3h，提取液减压蒸干得菌丝体的乙醇部位；发酵液减压蒸干得到发酵液的水部位。

2.4 MlC值测定

精确称量待测样品6.0 mg，加入150 μL的DMSO充分溶解，再加入1350μL的MH肉汤，将样品浓度稀释为2000，1000，500，250，125μg/mL，备用。在96孔平底微孔板中依次加入100μL的MH肉汤，50μL梯度稀释的样品溶液，50μL 0.5麦氏浓度的菌液，使待测样品的终浓度分别为1000，500，250，125，62.5，31.25μg/mL[ - ]。 阴性对照组为50μL1% DMSO的MH肉汤，阳性对照为50μL含50 μg/mL硫酸链霉素的MH肉汤。37℃培养箱静置培养12-18 h，然后每孔加入50 μL 100μg/mL INT（碘硝基四唑紫）显色剂，30min后观察颜色变化，以没有显示红色的最低浓度作为该样品对某一细菌的最小抑制浓度(MIC)。

3.结果

3.1 内生真菌的分离和初步鉴定

从藿香的花中共分离出13株内生真菌，根据其显微形态特征鉴定出其中菌株H-1为丝核菌属(Agonomyaetcssp.)，菌株H-3为长蠕孢菌属(Helminthosporium sp.)，菌株H-4、H-12及H-8为短蠕孢菌属(Brachysporium sp.)，菌株H-5、H-6和H-7为丝孢菌属(Hyphomycetessp.)、菌株H-9为链格孢菌属(Alternariasp.)、菌株H-11为镰刀菌属(Fusarium sp.)，菌株H-13为头孢霉属(Trichosporeaesp.)，菌株H-10未鉴定出结果。

3.2 内生真菌发酵产物各部位抗菌活性

本实验采用微量肉汤稀释法对藿香花中内生真菌次级代谢产物进行抑菌活性测定，阳性对照硫酸链霉素在50 μg/mL时对所有供试菌都有抑制活性，阴性对照组样品均显红色，表明抑菌试验模型良好，有抑菌活性的样品结果见表1，菌株H-2的乙酸乙酯部位抑菌活性最好，对6种供试细菌的MIC值均为250μg/mL；菌株H-9的乙酸乙酯部位对无乳链球菌的抑制作用很强，在31.25 μg/mL具有抑制作用，对其他供试细菌在500 μg/mL也具有抑制作用。次级代谢产物的正丁醇部位抑菌活性较好的为H-2、H-5、H-6和H-9，均能够在最大浓度1000 μg/mL时对这六种供试细菌表现出抑制作用，菌株H-4的正丁醇部位在浓度为1000 μg/mL时除了对金黄色葡萄球菌无抑制活性，对其他5种供试细菌均能够产生抑制作用。H-2的菌丝体的乙醇提取物在最大浓度1000 μg/mL对这六种供试细菌表现出抑制作用。13株内生真菌的次级代谢产物的水部位在最大浓度1000 μg/mL时对这六种供试细菌都没有表现出抑制作用。综上所述，藿香花中内生真菌次级代谢产物的乙酸乙酯部位与正丁醇部位对六种供试菌具有抑制作用，且乙酸乙酯部位的抑制作用较强。

表1 藿香内生真菌次级代谢产物的最低抑菌浓度(MlC,μg/mL)

4.讨论

通过查阅相关文献发现，藿香中内生真菌的种类与其次级代谢产物的生物活性的研究还未见报道，而与藿香同科不同属的植物广藿香的中的内生真菌被大量研究。广藿香中的优势菌株为拟茎点霉属、镰刀菌属等，同时也发现有弯孢属、黑孢霉属及曲霉属真菌的存在。可以发现镰刀菌属、黑孢霉属真菌是两种植物共同所都有的内生真菌。目前，我国常用的抑菌效果的评估方法主要是牛津杯法与滤纸片法，通过抑菌圈的大小来判断抑菌效果的强弱，此类方法难以进行大量样品的活性筛选，且抑菌物质的浓度低时可能无抑菌圈[ ]。因此，具有简便性和良好的方法学性能的微量肉汤稀释法测定MIC值，更适合检测大量样品的抗菌活性及临床药敏性试验。目前，国内外微量肉汤稀释法仅用于临床药敏试验与植物化学成分的抗菌活性的测定，而对植物内生真菌次级代谢产物的体外抗菌活性测定没有在相关文献中报道。采用微量肉汤稀释法可以快速准确筛选出具有良好抗菌活性次级代谢产物的极性部位，从而为后续具有抗菌活性的单体化合物的分离纯化提供活性导向。藿香内生真菌次级代谢产物的抗菌活性还未被报道出来，本实验通过测定藿香内生真菌次级代谢产物的体外抗菌活性，筛选出能够产生良好抗菌活性次级代谢产物的菌株，为利用发酵技术从藿香内生真菌次级代谢产物中生产抗菌剂及甘肃本地产藿香的开发利用提供了理论指导。