夜来香根茎总黄酮超声提取工艺*

张赛男，王妙飞，曾 靖，张 怡

(赣南医学院 药学院，江西 赣州 341000)

夜来香(Cestrum noctrnum，Linn)，又名夜香树、夜香花、夜丁香、洋素馨，为茄科夜香树属植物，原产于南美洲[1-5]，在我国集中分布在南方的广东、广西、福建等地，每年开花约6次。夜来香最早被《中国高端植物图鉴》[6]记载，其性温味辛，入胃经，其功效有行气止痛镇定，用于治疗胃脘痛。中国人为了观赏、驱蚊和药用有栽培夜来香的历史[7-8]。其夜间盛开花朵气味芬芳浓郁，常用来调配制成香精；它所含的挥发油成分有驱蚊的作用，所以又经常被制成驱蚊液等。夜来香的化学成分主要有挥发油类、皂苷类、黄酮类、多糖及酚类化合物等。

总黄酮的提取方法有很多，传统的有机溶剂提取法存在着提取液量大、溶剂回收率低和成本高等缺点。本实验拟采用水-乙醇为溶剂对夜来香根茎中总黄酮进行超声提取，采用硝酸铝显色法测定总黄酮的得率[9-11]。现报告如下。

1 材料、仪器与试剂

1.1植物材料从江西省采集得到夜来香药材。经过赣南医学院程齐来教授的鉴定，是茄科夜香树属植物夜来香(Cestrum noctrnum，Linn)的根茎。取夜来香根茎烘干粉碎过筛后备用。

1.2试剂与仪器芦丁标准品，购于成都普思生物科技股份有限公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯，购于福晨(天津)化学试剂有限公司；超纯水自制。

FWB5中草药粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；BSA224S分析天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；KQ-500DB数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；101-2-S-Ⅱ电热恒温古风干燥箱，上海跃进医疗器械厂；UV-6100PCS紫外-可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；Exceed-Ad-16艾柯实验室超纯水机，成都艾柯水处理设备有限公司。

2 方法和结果

2.1总黄酮的含量测定

2.1.1对照品溶液的制备万分之一分析天平取10.00 mg芦丁标准品，倒入50 mL容量瓶，倒70%乙醇到刻度线止，溶解均匀。制得浓度0.2 mg·mL-1的标准品溶液。

2.1.2供试品溶液的制备称取1.00 g夜来香根茎粉末，以料液比1∶20 g·mL-1加入70%乙醇，在超声温度30 ℃，超声(500 W，40 kHz)提取30 min。供试品溶液即为用70%乙醇进一步补充失重的重量的过滤得到的滤液。

2.2夜来香根茎总黄酮含量测定

2.2.1溶液的显色在比色管放入精准吸的2.5 mL样品溶液。首先用70%乙醇添加到5 mL刻度线处，接着移入0.3 mL 5%亚硝酸钠，混合静放6 min。接着加入0.3 mL 10%硝酸铝振摇均匀，混合静放6 min。继续加入4 mL 4%氢氧化钠溶液振摇均匀。最后用超纯水添加到10 mL处，混合后静放15 min。显色完成。

2.2.2检测波长的确定取对照品溶液和供试品溶液各2.5 mL，按照显色方法进行显色，显色后扫描波长，芦丁对照品溶液和夜来香根茎供试品溶液在510 nm处均有最大吸收波长，因此选择510 nm为检测波长。

2.2.3标准曲线的绘制精密量取芦丁对照品溶液0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3 mL、3.5 mL，按照“2.2.1”项下显色后于UV分光光度计测定吸光度，其中0.0 mL对照品作为空白对照，以芦丁吸光度为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程为：A=11.5C + 0.002 3，R2=0.999 9，样品浓度在0.011 1～0.077 7 mg·mL-1范围内与吸光度呈良好的线性关系。以芦丁对照品吸光度(A)为纵坐标，浓度(C，mg·mL-1)为横坐标，绘制标准曲线，标准曲线见图1。

2.2.4夜来香根茎总黄酮得率的计算取2.5 mL夜来香根茎供试品，显色后并测定吸光度。计算总黄酮的得率。总黄酮得率(%)=夜来香根茎中总黄酮质量/夜来香根茎质量×100%。

2.3单因素实验在其他条件均不变的条件下，研究料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40)、乙醇浓度(20%、30%、40%、50%、60%、70%)和提取温度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)对夜来香根茎总黄酮提取的影响。

以70%乙醇为提取溶剂，选择不同的料液比1∶15 g·mL-1、1∶20 g·mL-1、1∶25 g·mL-1、1∶30 g·mL-1、1∶35 g·mL-1、1∶40 g·mL-1进行提取，提取温度为30 ℃，提取时间30 min。不同料液比对夜来香根茎总黄酮得率的影响结果见表1。

表1 不同料液比对夜来香根茎总黄酮得率的影响

选择不同浓度的乙醇20%、30%、40%、50%、60%、70%进行提取，料液比为检测结果最优的1∶15 g·mL-1，提取温度为30 ℃，提取时间30 min。不同乙醇浓度对夜来香根茎总黄酮得率的影响结果见表2。

以检测结果最优乙醇浓度30%为提取溶剂，料液比为1∶15 g·mL-1，选择不同的提取温度30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃提取，提取时间30 min。不同提取温度对夜来香根茎总黄酮得率的影响见表3。

表2 不同乙醇浓度对夜来香根茎总黄酮得率的影响

表3 不同提取温度对夜来香根茎总黄酮得率的影响

2.4正交实验优选提取工艺在单因素实验基础上，设计L9(34)正交实验，研究料液比、乙醇浓度、提取温度对夜来香根茎总黄酮得率的影响。实验因素与水平设计见表4。

表4 实验因素与水平设计表

由表5可知，各因素对夜来香根茎中总黄酮得率的影响按大小依次排列，分别是提取温度、料液比、乙醇浓度。总黄酮最佳提取工艺组合是A3B1C3，即乙醇浓度为40%，料液比1∶25 g·mL-1，提取温度为80 ℃，此工艺组合提取的夜来香根茎总黄酮含量最高。

表5 总黄酮正交实验设计与结果

2.5总黄酮提取的方法学考察

2.5.1精密度考察精密吸取芦丁对照品溶液2.5 mL，显色完成后立即连续6次测定溶液的吸光度，芦丁对照品吸光值RSD 0.29%，说明仪器精密度良好，结果见表6。

2.5.2稳定性考察称取夜来香根茎粉末1.0 g，按照优选的最佳提取工艺进行提取显色，显色完成后立即测定吸光度，之后每隔10 min测一次吸光度，考察0～75 min内夜来香根茎总黄酮的稳定性。夜来香根茎供试品显色后在15～75 min内吸光度值RSD 0.42%，说明供试品显色后在15～75 min内保持稳定，因此，测定吸光度的时间为显色后的15 min，结果见表7。

2.5.3重复性考察称取夜来香根茎粉末1.0 g，按照优选的最佳提取工艺进行提取显色，显色完成后立即测定吸光度，重复试验6次，RSD 1.18%，说明此方法重复性良好，结果见表8。

表6 精密度考察结果

表7 稳定性考察结果

表8 重复性考察结果

2.5.4加样回收试验称取夜来香根茎粉末1.0 g，按照优选的最佳提取工艺进行提取，得到夜来香根茎待测液，加入和夜来香根茎中总黄酮含量相当的的芦丁对照品溶液，按照显色方法进行显色，显色完成后测定其吸光度，重复试验6次，计算得芦丁的平均加样回收率为92.00%，加样回收率的RSD 0.66%，说明此方法测定结果准确可靠，结果见表9。

表9 加样回收试验结果

3 讨 论

超声辅助提取是又快速又有效并且还环保的提取方法。为了能更大的减少提取时间，本实验充分利用超声波引起的强烈振动，空化和粉碎，提高夜来香根茎总黄酮的提取效果。通过实验结果可知夜来香根茎总黄酮的最佳工艺为超声提取。夜来香根茎总黄酮得率为0.135%。该方式简单且行之有效，不仅重复性好而且回收率高，不失为提取夜来香根茎总黄酮较为理想的方法。为夜来香根茎总黄酮的提取提供了可行依据。