根分泌物2, 4-二叔丁基苯酚对短花针茅荒漠草原土壤细菌群落的影响

高雪峰，韩国栋

1. 内蒙古师范大学生命科学与技术学院，内蒙古 呼和浩特 010020；2. 内蒙古农业大学草原与资源环境学院，内蒙古 呼和浩特 010022

植物根分泌物作为植物与土壤系统相互作用的介质，其为根际土壤微生物群落提供碳源和氮源基质的同时，驱动着根圈土壤中特定微生物群落的组装过程（Mangan，2010；Kateryna et al.，2018）。由于植物根系的活动，使得根际成为微生物生长繁殖的一个特殊生境，不同植物甚至同一植物的不同生长期，其根部分泌物都影响着根圈微生物的生长与繁殖（陶波等，2010；涂书新等，2010）。同时不同的根际微生物由于其生理代谢活动及代谢产物的差异也反过来影响土壤的活力，从而对植物营养选择和富集产生不同的作用（吴林坤等，2015）。根系分泌物的功能虽然无可争议，但是对复杂根系分泌物中特定化合物如何影响微生物群落结构尚不清楚（Hu et al.，2018）。

内蒙古短花针茅（Stipa breviflora）荒漠草原生境严酷、气候干旱、长期超载养畜等多种因素导致草地严重退化（古琛等，2017）。荒漠草原植物的根分泌物是植物长期适应其生存环境的产物，也是植物与土壤的化学通讯物质和相互作用的连接点，对其生物学功能的研究是了解荒漠草原植物化学生存机制的重要环节。酚酸类物质是植物根系产生的一类重要的次生代谢物质（何欢等，2011；张玉娟等，2012）。多数研究发现酚酸类物质具有化感作用，因而备受研究者们的重视。2, 4-二叔丁基苯酚（2, 4-bis (1, 1-dimethylethyl)-phenol，2, 4-BDP）是植物根分泌物中一种常见的酚酸物质，曲晓华等（2015）的研究发现大豆根分泌物中含有2, 4-BDP，而且证实了其具有化感作用，并提出其可能是导致大豆连作障碍的因素之一。Qu et al.（2008）研究表明，2, 4-BDP对土壤微生物量存在低浓度促进、高浓度抑制的作用。我们前期采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）对短花针茅荒漠草原建群种短花针茅（Stipa breviflora），优势种冷蒿（Artemisia frigida）和无芒隐子草（Cleistogenes songorica）3种植物的根分泌物组分的研究中，检测到3种植物根分泌物中均含有2, 4-BDP（高雪峰等，2016）。为了解其对内蒙古荒漠草原生态系统中土壤微生物群落的影响，本研究利用不同浓度的 2, 4-BDP处理荒漠草原土壤，并采用高通量测序技术分析了土壤中的细菌群落组成，以了解短花针茅荒漠草原优势植物根分泌物组分中2, 4-BDP的生物学效应，为植物根系分泌物的有效利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于内蒙古自治区乌兰察布盟四子王旗境内的短花针茅荒漠草原。属典型的大陆性气候，春季干旱多风，夏季炎热，年均降雨量280 mm，降水量集中在5－8月，草地类型为短花针茅（Stipa breviflora Griseb.）+冷蒿（Artemisia frigida Willd.）+无芒隐子草（Cleistogenes songorica Ohwi.）荒漠草原，植被草层低矮、稀疏，盖度为17%－20%。土壤为淡栗钙土，有机质含量较低，pH为 7.80－7.99。

1.2 土壤采集与处理

2016年8月，在内蒙古四子王旗短花针茅荒漠草原农业科学院草原研究所实验样地中，选择植被较少的裸地处挖取0－30 cm土壤500 g，装自封塑料袋带回实验室，风干后过1 mm土壤筛。将固态2, 4-BDP （sigma试剂公司，分析纯）溶于乙酸乙酯配制成饱和溶液原液，分别取原液0、125、395、625 μL于1000 mL玻璃瓶中，各玻璃瓶均加无菌水5 mL并摇晃2 min使其分散，然后加风干土50 g，用玻璃棒搅拌均匀并加盖密封。实验共设 4个处理，其中 2, 4-BDP 的浓度分别为 0 μL·g-1（CK）、2.5 μL·g-1（LG）、7.5 μL·g-1（MG）和 12.5 μL·g-1（HG）。每一处理设3重复，共12个样品。将玻璃瓶置于25 ℃恒温箱中培养3周。浓度的设置依据根系分泌物的实际浓度并参考了曲晓华等（2015）的方法确定。

1.3 土壤细菌群落分析

各土样的细菌群落分析委托上海生工生物公司采用Illumina Miseq高通量测序技术分析。引物采用341F（5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG-3'）和 805R（5'-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGA GAATTCCA-3'），对细菌16S rDNA基因V3－V4高变区进行了PCR扩增（Meyer，2006）。

50 μL 反应体系：10×PCR buffer 5 μL，dNTP（10 mmol·L-1）0.5 μL，Genomic DNA 10 ng，Bar-PCR primer F（50 μmol·L-1）0.5 μL，Primer R（50 μmol·L-1）0.5 μL，Plantium Taq（5 U·μL-1）0.5 μL。PCR 扩增条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，45 ℃20 s，65 ℃ 30 s，5个循环；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，20 个循环；72 ℃ 5 min。

PCR 体系：10×PCR buffer 5 μL，dNTP（10 mmol·L-1）0.5 μL，DNA 20 ng，primer F（50 μmol·L-1）0.5 μL，Primer R（50 μmol·L-1）0.5 μL，Plantium Taq（5 U·μL-1）0.5 μL，加水至 50 μL。95 ℃30 s；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s；72 ℃ 30 s，5 个循环；72 ℃ 5min。产物经琼脂糖电泳并回收，经Qubit 2.0 DNA检测试剂盒对 DNA定量，采用Illumina公司的Miseq 2×300平台测序。

1.4 数据处理和分析

测序得到的原始数据经FastQC质量控制后经FLASH拼接，再由Prinseq过滤掉低质量的序列。将相似度≥97%的有效序列聚类为OTU（Operational Taxonomic Units）。从每个OTU中选择1条代表序列，用RDP classifier数据库为每条代表序列分配分类单元。再用 QIIME对单样品组成分析，计算出样品的Coverage和Alpha多样性，包括Chao1指数、Shannon指数（Akiyama，et al.，2007；Cecile et al.，2003）。采用SPSS 17.0分别对细菌丰度进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 土壤细菌群落多样性分析

本研究对CK、LG、MG和HG 4组样本中土壤细菌群落多样性的高通量测序分析结果见表1。

由表1可知，本实验中对照处理的3个平行样本中共获得土壤细菌的有效序列为125786条，共产生OTUs 11317个。采用3个不同浓度的2, 4-BDP处理的样本 LG（2.5 μL·g-1）、MG（7.5 μL·g-1）和HG（12.5 μL·g-1）（各3个重复）共获得的细菌有效序列数分别为133961、138147、117324条，产生的OTUs分别为11888、10668、9036个。各样本的OTUs排序均LG＞CK＞MG＞HG，表明了不同浓度的2, 4-BDP对荒漠草原土壤细菌的影响不同，而且2, 4-BDP的加入会抑制部分细菌的生存和繁殖，同时也能促进另一些细菌类群数量的增加，最终导致土壤中细菌的群落组成发生一定的变化。采用Chao1指数计算群落物种丰富度，Shannon指数计算群落结构多样性。各样本中细菌的Shannon指数排序为LG＞CK＞MG＞HG。方差分析表明，在2.5－12.5 μL·g-1浓度范围内，低浓度 2, 4-BDP 对土壤细菌多样性无显著影响，中、高浓度2, 4-BDP使土壤细菌多样性显著降低，而且浓度越高，细菌多样性下降越显著。Chao1指数排序为MG＞LG＞CK＞HG。但本研究中不同浓度2, 4-BDP的添加，对土壤细菌菌群的丰富度均无显著影响。覆盖率（Coverage）能够反映测序结果是否代表样本的真实情况。经不同浓度2, 4-BDP处理后的土壤中细菌覆盖率范围为 94.17%－94.63%，说明所测结果可比较真实地反映各处理土壤样品中的细菌群落情况。

表1 不同浓度2, 4-BDP处理后土壤细菌OTUs多样性分析Table 1 Analysis of diversity of soil bacterial OTUs after treatment with 2, 4-bis (1, 1-dimethylethyl)-phenol at different concentrations

2.2 土壤细菌群落组成分析

不同浓度2, 4-BDP处理的各样本中OTUs的分类结果如表2（门水平）和表3（纲水平）所示。

对4个处理3个重复共12个样品进行统计，共获得细菌36门77纲94目191科528属。其中CK处理125786个序列中，隶属于29门54纲72目135科270属。LG处理133961个序列中，隶属于25门54纲73目129科277属。MG处理138147个序列中，隶属于26门55纲73目127科285属。HG处理117324个序列中，隶属于26门56纲80目130科93属，其中CK、LG、MG和HG共有的细菌有21门。显示了加入2, 4-BDP后，土壤中原有的一些细菌被抑制了，同时也出现了一些新的种类。

在门水平，对照土壤至少隶属于29个不同的细菌门，将其中丰度排序于前 15位的细菌门列于表 2。其中酸杆菌门（Acidobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为土壤荒漠草原细菌中的优势种，它们的丰度分别为45.93%、19.97%和 14.27%。其余依次为疣微菌门（Verrucomicrobia，丰度 3.91%），放线菌门（Actinobacteria，丰度 3.14%），芽单胞菌门（Gemmatimonadetes，丰度 3.07%），浮霉菌门（Planctomycetes，丰度 1.95%），厚壁菌门（Firmicutes，丰度1.68%），绿湾菌门（Chloroflexi，丰度1.27%）和candidate division WPS-1（丰度1%），其余各细菌门的丰度均低于1%。经2, 4-BDP处理后各土壤中主要细菌门的变化为：放线菌门和厚壁菌门丰度的排序为HG＞MG＞LG＞CK，表现出随2,4-BDP浓度的增加而呈增加的趋势。其中 MG和HG增加幅度达显著水平（P＜0.05）；酸杆菌门和绿湾菌门丰度排序为 CK＞LG＞MG＞HG，即随 2,4-BDP浓度增加其丰度呈逐渐降低趋势，且各样本间变化差异显著（P＜0.05）；拟杆菌门、疣微菌门和浮霉菌门的排序也为 CK＞LG＞MG＞HG，但 LG较 CK降低不显著，MG和 HG降低达显著水平（P＜0.05）；变形菌门的丰度排序为MG＞LG＞CK＞HG，即随2, 4-BDP浓度的增加其丰度先增加后降低。其中MG和LG较CK显著增加（P＜0.05），表明不同浓度2, 4-BDP对放线菌门和厚壁菌门均有显著促进作用，对酸杆菌门和绿湾菌门都有显著抑制作用。中、高浓度的2, 4-BDP对拟杆菌门、疣微菌门和浮霉菌门也有显著抑制作用。2, 4-BDP对变形菌门的作用表现为低促高抑的浓度效应。

表3 2, 4-BDP处理后土壤细菌群落组成及相对丰度（纲水平）Table 3 Soil bacterial composition and their relative abundance at class level after treatment with 2, 4-bis (1, 1-dimethylethyl)-phenol

在纲水平，将 CK中序列相对丰度≥0.5%的各纲在经不同浓度2, 4-BDP处理后细菌菌群的变化结果见表3。由表3可知，经不同浓度2,4-BDP处理后，各样本中酸酐菌门中 Acidobacteria_Gp4、_Gp6、_Gp25、_Gp7的丰度均显著降低，而且随其浓度的增加逐渐降低；拟杆菌门中的Sphingobacteriia、Bacteroidetes_incertae_sedis、Flavobacteriia和 Cytophagia的丰度也显著降低，Spartobacteria、Subdivision3和 Nitrospir的丰度也随2, 4-BDP浓度的增加而逐渐减少；以上各纲大多在低浓度（2.5 μL·g-1）时其丰度就已显著降低了。2, 4-BDP对CK中的3个优势纲Acidobacteria_Gp4（31.22%）、Sphingobacteriia（11.34%）和Acidobacteria_Gp6（9.97%）的抑制作用更强。

经不同浓度2, 4-BDP处理后，变形菌门中的4个纲的变化规律差异很大。其中，Alpha-proteobacteria的丰度先增加后降低，中浓度（7.5 μL·g-1）时达峰值。Gamma-proteobacteria的相对丰度在中、高浓度处理中显著增加，低浓度影响不显著。而 Delta-proteobacteria的丰度则随 2,4-BDP浓度的增加而逐渐降低，中、高浓度的抑制效应显著。2, 4-BDP对Beta-proteobacteria无显著影响。Actinobacteria和Bacilli的丰度随2, 4-BDP浓度的增加而显著增加，且在高浓度（12.5 μL·g-1）时达峰值。Gemmatimonadetes、Planctomycetia和Clostridia 3个纲受2, 4-BDP的影响不显著。分类结果还显示，各样品中仍有少量序列（2.71%－6.47%）未被分归到任何现存的纲类（unclassified），说明内蒙古荒漠草原土壤中还保存着有未被认识的细菌资源。此外，还有近35纲的含量较低，占总序列量的2.56%－3.70%。

在属水平，CK土壤中共检测到细菌270属，其中相对丰度＞1%的有 15属，其他细菌属的丰度均较低。丰度最高的5属依次为Gp4 (30.47%)＞Gp6(9.97%)＞Sphingomonas(4.44%)＞Pseudomonas (3.67%)＞Gemmatimonas (3.17%)。方差分析表明，与CK相比，加入2, 4-BDP后，相对丰度显著增加（P＜0.05）的细菌属主要有Pseudomonas、Rhizobium、Gaiella、Solirubrobacter、Conexibacter、Micromonospora、Aciditerrimonas、Bacillus、Thermoleophilum、Gp16和Filimonas，而且其丰度都有随2, 4-BDP浓度增加而增加的趋势。相对丰度显著降低（P＜0.05）的细菌属主要有 Gp4、Gp6、Gp25、Gp7、Blastocatella、Parasegetibacter、Flavitalea、 Flavisolibacter、Chitinophaga、Terrimonas、Niastella、Arthrobacter，Nitrospira 和 Pirellula。而 Sphingomonas和gromyces的丰度随2, 4-BDP浓度增加呈先增加后降低的趋势，中浓度（7.5 μL·g-1）时丰度最大，并显著高于CK。

图1 2, 4-BDP处理后各样本细菌的UPGMA聚类分析Fig. 1 UPGMA analysis of soil bacteria among the samples after treatment with 2, 4-bis (1, 1-dimethylethyl)-phenol

2.3 土壤细菌群落结构相似性分析

样本聚类树图可以直观地反映出样本间的相似度。基于CK、LG、MG与HG的OTU丰度值，根据 Beta多样性距离矩阵进行层次聚类（Hierarchical clustering）分析，使用非加权组平均法 UPGMA（Unweighted pair group method with arithmetic mean）算法构建CK、LG、MG与HG的树状结构，并计算出4组样本间的Bray-Crutis距离（图1），以分析不同浓度2, 4-BDP处理后土壤细菌群落结构的相似性与差异性，图中树枝的长度代表样本间的距离，越相似的样本越靠近，且同一颜色的树枝表示来源于同一组。

图1显示，CK、LG、MG和HG 4组样本的相似度约为66%，在66%的相似水平下，4组样本的土壤细菌群落结构聚为二大簇。其中，CK与 LG聚成一簇，二者相似度为76%。MG与HG聚为另一簇，二者相似度为82%。表明2, 4-BDP浓度为2.5 μL·g-1时土壤细菌群落结构与对照相比变化较小，而当其浓度增加到7.5 μL·g-1时，土壤中细菌群落结构就发生了显著变化。2, 4-BDP的浓度在7.5 μL·g-1和 12.5 μL·g-1时的土壤细菌群落结构变化不大，表明当土壤中的2, 4-BDP浓度达7.5 μL·g-1就会显著改变土壤中的微生物群落组成与结构。聚类分析结果表明2, 4-BDP对土壤细菌群落结构有较大影响，且浓度越大其对土壤中细菌群落结构的影响越大。

3 讨论

本研究发现根系分泌物2, 4-BDP对草原土壤细菌群落组成及多样性会产生显著影响，并呈现一定的浓度效应。低浓度时2, 4-BDP对土壤细菌多样性无显著影响，而其浓度达7.5 μL·g-1时土壤细菌多样性显著降低，并有随浓度增加而逐渐降低的趋势。不同浓度2, 4-BDP均对土壤细菌菌群的丰富度无显著影响，但导致土壤细菌的群落组成发生显著变化，且浓度越大影响越大。其中2, 4-BDP对酸杆菌门、变形菌门、放线菌门和厚壁菌门的细菌所产生的影响均达显著水平，但对各门中不同细菌属的影响有差异。

酸杆菌门是内蒙古荒漠草原土壤的优势菌。2,4-BDP对酸杆菌门有显著抑制作用。特别对其中的优势细菌属Gp4、Gp6、Gp25、Gp7和Blastocatella均有显著抑制作用。现有研究认为，酸杆菌门是土壤微生物的重要成员（Kucey et al.，1989），但由于其难于培养和生长缓慢的特点（王光华等，2016），目前学术界对酸杆菌在自然环境中的功能还知之甚少（唐勇等，2001；龚明波，2011；贾美清等，2016）。Kielak et al.（2009）发现百脉根（Festuca ovina）和野生羊茅（Lotus corniculatus）根际土壤酸杆菌丰度显著低于非根际土壤，根际中Gp6和Gp3丰度高于非根际，而非根际中Gp1和Gp4丰度高于根际。Berg（2009）的研究也发现酸杆菌门更喜欢可利用碳源贫瘠的寡营养生存环境，这与我们的研究结果较为相似，说明2, 4-BDP的添加使土壤中有机碳的增加，是引起酸杆菌门中多数细菌属显著降低的重要原因。同时，对照土壤中酸杆菌的丰度最高也证明了内蒙古荒漠草原土壤养分贫瘠的事实。

2, 4-BDP对厚壁菌门和放线菌门的影响整体表现为显著促进作用。其中，对厚壁菌门中的Bacillus和Thermoleophilum属有显著促进作用，特别是Bacillus的丰度随2, 4-BDP浓度增加而极显著增加。而 Bacillus是已被多次证实的根系促生菌（Antoun et al.，2001）。刘婷（2016）在对高寒草甸优势植物根际促生菌研究中分离到的15株菌株均属 Bacillus。巩瑞红（2014）对短花针茅荒漠草原中5种植物的根际可培养细菌研究中均分离到了Bacillus，并证实了其既具固氮能力又具溶磷能力。2, 4-BDP对放线菌门中的Gaiella、Solirubrobacter、Conexibacter、Micromonospora和 Aciditerrimonas等属有显著促进作用，对Agromyces有低促高抑的作用，而对Arthrobacter有显著抑制作用。

2, 4-BDP对变形菌门的影响表现为低促高抑的作用。其中对Pseudomonas和Rhizobium属有显著促进作用，而对 Sphingomonas属有低促高抑的浓度效应。Pseudomonas是已被证实为既具有固氮作用又具有溶磷作用的根系促生菌，对植物的生长有显著的促进作用（Berg，2009），但其对环境的适应能力较差，相比于其他根际微生物竞争较弱，营养物浓度是其主要影响因素（凃月等，2019）。Rhizobium也是很早被认知的具有固氮作用的细菌（秦嗣军等，2011）。Sphingomonas也已被证实是具有溶磷能力的根系促生菌（周文杰等，2015）。巩瑞红等（2014）采用Ashby无氮培养基和无机磷培养基对四子王旗短花针茅荒漠草原的短花针茅、无芒隐子草、银灰旋花（Convolvulus ammannii）、多根葱（Allium polyrhizum）和沙葱（Allium mongolicum）的根际固氮、溶磷细菌的群落多样性研究中也分离得到Pseudomonas和Sphingomonas。这些研究揭示了2, 4-BDP在低浓度时有利于土壤细菌群落组成的优化。

拟杆菌门也是土壤微生物中主要的常见菌群。吾尔恩·阿合别尔迪等（2017）检测到新疆过度放牧草地土壤中包含有拟杆菌门，但其丰度较低。本研究中测得的拟杆菌门的丰度为 14.27%，仅次于酸杆菌门和变形菌门。2, 4-BDP在低浓度时对拟杆菌门无显著影响，但当其浓度达7.5 μL·g-1时，对拟杆菌门的丰度有显著抑制作用，特别使Parasegetibacter、Flavitalea、Flavisolibacter、Chitinophaga、Terrimonas和Niastella等的丰度显著下降。田锐等（2016）对辽宁盘锦三角洲翅碱蓬（Suaeda heteroptera）根系细菌群落多样性进行研究，发现在根系附着物样品中拟杆菌门占16.33%，在根系土壤样品中拟杆菌门占 37.47%，表明根际土壤中拟杆菌门的丰度明显降低，暗示根系分泌物对拟杆菌门有抑制作用，与本研究结果类似。

总体而言，低浓度2, 4-BDP可促进土壤中有益菌的丰度显著增加，有助于改善土壤细菌群落结构。但当其浓度达到一定值后，部分根系促生菌会被抑制而且土壤细菌多样性下降，不利于土壤环境良性发展。前期检测到短花针茅、冷蒿和无芒隐子草根分泌物中2, 4-BDP的相对丰度均较低，分别为1.47%、1.75%和4.08%（高雪峰等，2016），由此推测植物可能具备调控根系分泌物的能力。

4 结论

内蒙古荒漠草原优势种植物根系分泌 2,4-BDP进入到土壤中后，会对根圈土壤细菌群落组成及多样性产生显著影响。总体表现为浓度较低时，对土壤细菌多样性和丰富度无显著影响，能够促进根系促生菌 Pseudomonas、Rhizobium、Sphingomonas和Bacillus的繁殖，而且不会导致细菌群落多样性和丰富度发生显著变化，有助于改善土壤细菌群落结构；但当其在土壤中积累到一定浓度后，虽然也能促生一些益生菌的繁殖，但会导致部分细菌死亡，最终使土壤的细菌多样性显著降低，不利于土壤环境稳定性的维持。