糖对莲藕实生苗不定根形成及过氧化物酶活性的影响

刘慧颖 韩玉燕 蒋润枝 程立宝

摘要：利用不同浓度蔗糖、葡萄糖、果糖溶液处理莲藕实生苗，研究不同糖处理对莲藕实生苗不定根形成和过氧化物酶（POD）活性的影响。结果表明10、20、30 g/L蔗糖处理的实生苗均能促进莲藕不定根的形成，而50 g/L的蔗糖具有明显的抑制作用。利用10、20、30 g/L葡萄糖处理的莲藕实生苗与对照相比无明显变化，40 g/L和50 g/L的葡萄糖对不定根发生起明显抑制作用。利用10、20、30、40、50 g/L的果糖处理莲藕实生苗，前期与对照相比无明显变化，后期随着果糖溶液浓度的升高，对不定根的形成具有抑制作用。利用不同浓度蔗糖处理莲藕实生苗，观察POD活性的变化，结果表明不同浓度蔗糖处理过的莲藕实生苗POD活性在0～8 d均呈现先下降后上升再下降的趋势。总之，不同类型的糖影响莲藕实生苗不定根的形成效果不同，这为进一步挖掘调控莲藕不定根形成的机制奠定了坚实的理论基础。

关键词：糖类;莲藕;不定根;过氧化物酶;实生苗

中图分类号： S645.101  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）16-0155-04

收稿日期：2019-01-16

基金项目：江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（18）3066];江苏省和扬州大学“研究生培养创新工程”项目（编号：XSJCX18_070）。

作者简介：刘慧颖（1994—），女，江苏泰州人，硕士研究生，主要从事莲藕生长发育调控机制的研究。

通信作者：程立宝，博士，副教授，主要從事蔬菜遗传育种与分子生物学。

莲藕（Nelumbo nucifera Gaertn）是睡莲科（Nymphaeaceae）莲属多年生水生草本植物[1]，种质资源丰富[2]。原产于印度，后来引入中国，是我国栽培面积最大的水生蔬菜[3]。以膨大根状茎（俗称藕）供食用，且药用价值相当高，深受广大人民的喜爱，是我国主要出口创汇型蔬菜之一[4]。莲藕的根有2种，一种是主根，另一种是不定根。主根是莲子播种后，由种子的胚根所形成的，但主根不发达，不定根直接影响莲藕植株的生长发育。莲藕不定根较多，发达的不定根不仅起到固定、支持植物的作用，还能从土壤中吸收植物生长发育必需的水分和无机盐。糖起到提供营养成分和信号分子的双重作用，且与植物激素作用影响根系生长发育[5]。

糖类又称碳水化合物，是多羟基醛或多羟基酮及其缩聚物和某些衍生物的总称[6]，一般由碳、氢与氧3种元素所组成[7]，是植物体内重要的碳源和能源[8]，它不仅参与能量代谢，还调控植物的生长发育和生理过程，糖类在种子萌发、生根、发育等方面都有举足轻重的作用[9]。

蔗糖为等量的葡萄糖和果糖结合而成，是植物体内碳水化合物运输的主要形式，也是光合作用的主要产物，有储藏、积累和运输糖分的作用。蔗糖在体内能被充分氧化分解产生CO2和H2O，并提供能量，是生物重要的碳源和能量提供者，同时蔗糖是生物细胞、蛋白质等的必需组成成分，因此它在生物的生长发育、代谢生理和繁殖等过程中发挥着重要的作用[10]。葡萄糖易溶于水，是自然界中最为重要且分布最广的一种单糖，在植物的生长与干物质的积累方面具有积极作用[11]，也是新陈代谢中间产物和活细胞的能量来源，植物可通过光合作用产生葡萄糖[12]。果糖是葡萄糖的同分异构体，它能与葡萄糖结合生成蔗糖[13]。

过氧化物酶（POD）是活性较高的一种酶，大量存在于植物体内，在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化，参与呼吸作用和光合作用，同时与生长素代谢密切相关[14]。我们前期证明了生长素是莲藕不定根形成的直接调控者，所以本试验在研究蔗糖、葡萄糖和果糖对莲藕实生苗不定根形成影响的基础上，进一步探讨了蔗糖处理对莲藕植株POD活性的影响，为进一步探究糖及激素调控莲藕不定根形成的机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为莲藕品种太空莲36号，由扬州大学园艺与植物保护学院提供。

试验仪器主要有离心机和酶标仪;试剂主要有过氧化物酶（peroxidase，POD）试剂盒。

1.2 糖对莲藕实生苗不定根形成的影响试验

将莲藕种子放置于RXZ-300D智能人工气候箱（浙江宁波东南仪器有限公司制造）中培养，白天温度设为30 ℃，夜间温度设为24 ℃，湿度设为70%;待莲籽充分吸水（2片子叶有裂缝）破壳后，选取长势相似的实生苗放置于塑料盒（长22 cm×宽15 cm×高16 cm）中。该试验于2017年10月开展。利用不同浓度的蔗糖、葡萄糖和果糖（表1）处理莲藕实生苗3 d后换清水培养，每个处理设置3个重复，每个重复50株实生苗，2 d更换1次清水。

1.3 莲藕实生苗不定根数量的测定

待莲藕实生苗长出不定根之后，统计根长≥0.5 mm的所有实生苗不定根数量，计算生根率：生根率=生根种子数/种子总数×100%。

1.4 POD活性测定

采用过氧化物酶试剂盒测定样品中过氧化物酶的活性（苏州科铭生物技术有限公司提供）。按照提取液体积（mL） ∶组织质量（g）为10 ∶1的比例，在1 mL提取液中加入0.1 g混合样品的，进行冰浴匀浆，在4 ℃下10 000 g离心机上离心10 min，提取上清，放置冰上待测。测定步骤如下：

（1）将酶标仪或分光光度计预热30 min以上，调节波长至470 nm，蒸馏水调零。

（2）将试剂一、试剂二、试剂三在测定前室温放置10 min以上，然后进行表2所示操作;在96孔板或微量石英比色皿中按顺序依次加入表2中试剂，并立即混匀计时，在470 nm下记录30 s和90 s的吸光度D1、D2。

（3）POD活性的计算。单位定义：在1 mL反应体系中 1 g 组织1 min D470 nm变化0.005为1个酶活力单位。

POD（U/g）=V总×ΔD÷（V样×m÷V提）÷0.005÷T=4 000×ΔD÷m。

式中：V总为反应体系总体积，mL;V样为加入样本体积，mL;m为样本质量;V提为加入提取液体积，mL;T为反应时间，min;ΔD=D2-D1。

1.5 数据分析

试验数据采用SPSS 16.0软件中One-Way ANOVA、Excel分析Duncans法（P<0.05）进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 蔗糖对莲藕实生苗不定根形成的影响

2.1.1 不同浓度蔗糖处理对莲藕实生苗不定根数量的影响 利用不同浓度的蔗糖溶液（10、20、30、40、50 g/L）处理莲藕实生苗，结果（图1）表明，低浓度的蔗糖处理在调查天数内显著增加实生苗不定根数量，其中20 g/L的蔗糖处理效果显著好于10、30、40、50 g/L的处理。研究发现在1～6 d，20 g/L和30 g/L的蔗糖处理莲藕实生苗后，不定根形成数量均显著高于清水对照，而10 g/L蔗糖处理在前期促进作用不明显，后期促进效果逐渐增强;40 g/L蔗糖的处理在1～6 d内不定根形成的数量与对照相比无明显差异，而50 g/L的浓度显著抑制莲藕实生苗不定根的形成。以上结果表明，低浓度蔗糖促进莲藕实生苗不定根的发生，而高浓度的蔗糖起到抑制作用。

2.1.2 蔗糖对莲藕实生苗不定根生根率的影响

由表3可见，不同浓度的蔗糖对莲藕实生苗生根率的影响不同，与其他浓度的蔗糖处理和对照对比，10 g/L蔗糖溶液处理后实生苗生根效果最好，在6 d时生根率已达97%。20、30、40 g/L蔗糖的处理，在1～6 d时不定根生根率也显著高于对照。50 g/L 蔗糖处理实生苗后，不定根生根率显著低于对照。上述结果表明，低浓度的蔗糖加速不定根的形成，而高浓度的蔗糖延缓了不定根的形成过程。

2.2 葡萄糖对莲藕实生苗不定根形成的影响

2.2.1 葡萄糖对莲藕实生苗不定根形成数量的影响 由图2可见，利用同浓度的葡萄糖处理莲藕实生苗，在处理后的 1～6 d，10 g/L和20 g/L的处理与对照相比，不定根数量无明显变化，40 g/L和50 g/L的葡萄糖显著抑制了莲藕不定根形成的数量。30 g/L葡萄糖的处理在1～4 d时，与对照相比无显著变化，在5～6 d时，不定根形成数量显著少于对照。综上所述，低浓度葡萄糖对莲藕实生苗不定根的发生无明显作用，而高浓度葡萄糖具有显著的抑制效果。

2.2.2 不同浓度的葡萄糖对莲藕实生苗不定根生根率的影响

莲藕实生苗在不同浓度葡萄糖处理下，其生根率如表4所示，处理后1～4 d，与对照相比，10、20、30、40 g/L处理下的实生苗不定根发生率无明显变化，而浓度达到50 g/L时，不定根的发生明显变迟缓。处理后5～6 d，除5 d时50 g/L处理外，各个处理和对照之间不定根发生率差异不显著。

2.3 果糖对莲藕实生苗不定根形成的影响

2.3.1 果糖对莲藕实生苗不定根形成数量的影响

利用10、20、30、40、50 g/L的果糖处理莲藕实生苗，研究其对莲藕实生苗不定根形成数量的影响。结果（图3）表明：在1～6 d时，10 g/L 和20 g/L的果糖对莲藕实生苗不定根的形成与对照相比无显著差异。30 g/L和40 g/L的果糖在1～4 d时与对照相比变化不明显，在5～6 d时，不定根数量显著低于对照。50 g/L果糖显著抑制了不定根的发生，在1～6 d时不定根数量明显低于对照。

2.3.2 果糖对莲藕实生苗不定根生根率的影响

莲藕实生苗在不同浓度果糖处理下生根率的变化如表5所示，10、20、30、40、50 g/L的果糖处理后，生根率在1～2 d时均高于对照，在3～6 d时，不同浓度果糖溶液处理过的莲藕实生菌不定根生根率与对照相比均无明显变化。

2.4 蔗糖对莲藕不定根POD活性的影响

由图4可知，不同浓度蔗糖处理的莲藕实生苗不定根POD活性在0～8 d均呈现先下降后上升再下降的趋势。0 d时，30 g/L蔗糖处理下的莲藕实生苗POD活性最高，与 20 g/L 和40 g/L处理的差异不显著，但均显著高于对照。在2 d时，所有浓度蔗糖处理的实生苗POD活性均高于对照组，且40 g/L>30 g/L>20 g/L>50 g/L>10 g/L。处理后8 d，10 g/L 和20 g/L的蔗糖处理显著高于对照及其他处理，其他浓度蔗糖处理之间差异不显著。

3 结论

本研究发现，20 g/L蔗糖溶液能够显著提高莲藕实生苗不定根数量和生根率，而50 g/L蔗糖对不定根形成的数量和生根率起到显著的抑制作用。低浓度的葡萄糖对不定根形成无明显作用，而高浓度的葡萄糖和果糖显著抑制了不定根的发生;低浓度的果糖虽然对不定根数量没影响，但加速了不定根的发生时间。蔗糖处理后莲藕实生苗POD活性呈现先下降后上升再下降的趋势。

4 讨论

Takahashi等已发现，蔗糖、葡萄糖和果糖可以明显促进拟南芥下胚轴不定根的发生[15]。耿贝贝等研究表明低浓度蔗糖（1 g/L）可以诱导黄瓜不定根发生，而高浓度蔗糖（5～50 g/L）则不同程度抑制不定根的发生[16]。本试验结果与之一致。胡江琴等报道高于5 g/L的蔗糖（20～120 g/L）对绿豆下胚轴不定根发生有不同程度的抑制作用[17];但在丹参上观察到高浓度蔗糖（60 g/L）反而有利于不定根生长[18]。黄韬等在对人参不定根培养的研究中发现40 g/L的蔗糖最有益于人參不定根的生长，当蔗糖浓度比较低时，不定根的生长状态较差，高浓度的蔗糖却对不定根的生长有一定的促进作用[19]。本研究发现，低浓度蔗糖（10～30 g/L）可以诱导莲藕不定根形成，而高浓度蔗糖（40～50 g/L）则不同程度抑制了不定根的发生。葡萄糖和果糖在低浓度（10～30 g/L）无营养条件下对莲藕不定根的形成数量无明显影响，高浓度起抑制作用（40～50 g/L）。本试验结果与耿贝贝等人试验结果相似，与黄韬等人研究结果有出入，说明不同类型的糖对不同物种的作用可能不同。

POD参与了植物生长发育的全过程，随着物种种类和生长发育阶段等不同，POD活性会发生变化。韩晴在对槐种子发育过程的研究中发现，在花后60～90 d，种子叶细胞过氧化物酶活性从低到高，然后又呈现降低的变化趋势[20]，本试验结果与之相似，我们利用蔗糖处理莲藕实生苗，发现在0～8 d内POD活性呈现先下降后上升再降低的规律，说明莲藕实生苗不定根POD活性可能与蔗糖浓度有关。研究表明生长素调控了莲藕不定根的形成[21]，而POD活性与生长素代谢密切相关，所以过氧化物酶可能通过影响莲藕实生苗中生长素含量，进而影响不定根的发生。

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