红光预照射对紫花苜蓿幼苗UV-B抗性的影响

王丹 王茹丹 姜静 王静 李景原 王太霞

摘要：为探讨红光预照射对植物UV-B抗性的影响，以紫花苜蓿为材料，以日光灯为对照，设置UV-B、RL-UV、RL-DRL-UV 3种处理。结果表明，与对照相比，UV-B辐照对紫花苜蓿的光合特性和光合色素都有一定的抑制作用，并使紫外吸收物质含量增加，抗氧化酶（SOD、CAT）活性升高;在UV-B辐照之前增加红光（RL）预辐照处理，紫花苜蓿的光合特性和光合色素含量均有所升高，紫外吸收物质的含量降低，抗氧化酶的活性升高，说明红光预辐射能够缓解UV-B辐照对紫花苜蓿造成的损伤，增强其对UV-B辐照的抗性;而进一步增加远红光的辐射处理后，红光对苜蓿幼苗的保护作用消失。

关键词：紫花苜蓿;UV-B辐射;光合特性;抗氧化;SOD活性;CAT活性

中图分类号： Q945.78;S541+.101  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）16-0179-04

收稿日期：2018-04-04

基金项目：国家自然科学基金（编号：31270225、U1504316）;河南省教育厅项目（编号：15A180015）;河南省高校重点项目（编号：16A180045）;河南师范大学青年科学基金（编号：2014QK19、2015QK16）。

作者简介：王 丹（1981—），女，河南南阳人，博士，讲师，主要从事植物发育及分子生物学研究。

通信作者：王太霞，博士，教授，主要从事药用植物学研究。

太阳光是地球能量的主要来源，其中紫外线（ultraviolet）根据波长的不同可以分为UV-A（315～400 nm），UV-B（280～315 nm）和UV-C（100～280 nm）[1]。UV-A很少被空气中的臭氧层吸收，但是辐射作用非常小，一般无杀伤力;UV-B大部分可以被臭氧层吸收，有约10%会到达地面，有研究表明它可以诱导植物产生一系列生理反应，影响植物的生长代谢[1]。而UV-C尽管对生物的辐射伤害非常大，但是却被臭氧层吸收而无法到达地面。近年来，环境污染导致臭氧层遭受到了严重的破坏，使得到达地球表面的紫外辐射有所增强，因此，探究植物对UV-B辐射的响应机制，寻求增强植物UV-B抗性的新途径已经成为一个研究热点。

UV-B辐射可以诱导植物体内多种保护物质的产生，例如抗氧化酶、伴侣蛋白、类胡萝卜素和黄酮类等低分子抗氧化物，这些保护物质可以帮助植物抵抗UV-B辐射造成的伤害[2-4]。近年来人们发现植物对UV-B的防御系统不仅能被UV辐射所激活，也可以被低剂量的处于蓝光和红光波段的可见光所激活[5-6]。Beggs等对玉米的研究发现，持续的红光照射能大大增强由UV-B所诱导的花青素合成[7]。这是因为光敏色素能够调节花青素合成途径中的2个关键酶——苯丙氨酸解氨酶（PAL）[8]以及查尔酮合成酶（CHS）的活性[9]。范雅等利用红色LED灯处理绿豆，发现相较于自然光组，红色LED灯处理绿豆可以提高光合效率[10]。人们推测，红光对植物具有保护功能，使其免受UV-B辐射伤害，可能是红光诱导了光敏色素的产生，从而激发了受光敏色素直接调节的酶活性，提高了生理生化代谢机能，促进植物初生代谢水平[11]。紫花苜蓿（Medicago sativa L.）别称紫苜蓿，由于其适应性广、产草量高，且富含蛋白质、维生素和矿物质等营养物质，被誉为“牧草之王”。我国苜蓿种植面积约3.77×106 hm2，居各类人工草地之首[12]。因此，研究紫花苜蓿对环境的适应机制具有重要的农业价值。近年来，我国臭氧总量一直在下降，作為苜蓿的重要产区，如青藏高原，一方面其对全球气候变化敏感，其上空臭氧消耗更严重，全年维持低值[13];另一方面，其气候稀薄，地势高，悬浮颗粒物少，到达地球表面的UV-B辐射较高[14-16]。因此，研究红光预照射对紫花苜蓿幼苗UV-B抗性的影响，旨在为探究紫花苜蓿 UV-B 逆境适应变化过程中的调控机制，也为提高苜蓿的产量和营养品质提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与光源

本试验材料为紫花苜蓿，品种为金皇后，试验所用光源分为UV-B（308 nm，0.35 W/m2）、红光（RL，λmax=664 nm，100 W/m2）、远红光（DRL，λmax=730 nm，1.5 W/m2），光照强度为2 800 lx。试验时间为2017年3—7月，试验地点为河南师范大学生命科学学院植物组实验培养间。

1.2 试验设计

以室内正常生长4周时间的紫花苜蓿幼苗为试验材料，将其分为4组，进行不同的光照处理：以日光灯辐照作对照（CK），UV-B组紫外辐射处理2 h;RL-UV组先进行10 min红光预辐射，再紫外处理2 h;RL-DRL-UV组先进行 10 min 红光预辐射，再进行10 min远红光预辐射，然后紫外处理2 h。处理完毕后，将苜蓿置于黑暗环境中0.5 h后测定各项指标。不同光照处理的紫花苜蓿见图1。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 光合作用参数的测定 光合作用速率、气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率参数选用LI-6400XT光合仪（LI-COR）在实验室随机选取5株紫花苜蓿直接活体测定。 测定时间为15：00—17：00。

1.3.2 叶绿素和类胡萝卜素含量测定 使用分光光度法[17]，紫外吸收物质含量测定采用1%盐酸-甲醇法;超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用氮蓝四唑法;过氧化氢酶（CAT）活性测定采用过氧化氢法[18]。

1.4 数据处理

试验所有指标均重复测定3次，光合特性指标重复5次。使用Microsoft Excel 2010和GraphPad Prism 6软件进行数据录入、计算以及图表绘制。用SPSS 14.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理下紫花苜蓿的光合特性参数

由表1可知，与对照相比，UV-B、RL-UV、RL-DRL-UV 3组辐照处理中，紫花苜蓿的光合速率均出现了极显著下降，分别是0.53、2.95、0.37 μmol/（m2·s），较对照分别下降了93.09%、61.54%、95.18%，，光合速率排序依次为CK>RL-UV>UV-B>RL-DRL-UV。与对照相比，UV-B、RL-UV、RL-DRL-UV 3组辐照处理中，紫花苜蓿的气孔导度均出现了极显著下降，分别是54.94、47.06、69.66 mol/（m2·s），较对照分别下降了 31.48%、41.31%、13.12%，气孔导度排序依次为CK>RL-UV>UV-B>RL-DRL-UV。与对照相比，UV-B、RL-UV、RL-DRL-UV 3组辐照处理中，紫花苜蓿的胞间CO2浓度均出现了极显著上升，分别是366.53、376.52、273.16 μmol/mol，较对照分别上升了75.19%、7996%、30.56%，胞间CO2浓度排序依次为RL-UV>UV-B>RL-DRL-UV>CK。与对照相比，UV-B、RL-UV、RL-DRL-UV 3组辐照处理中，紫花苜蓿的蒸腾速率均出现了极显著下降，分别是1.44、1.86、1.28 mmol/（m2·s），蒸腾速率排序依次为CK>RL-UV>UV-B>RL-DRL-UV。這说明UV-B辐照会导致苜蓿光合特性降低，经过红光预辐照处理可以减缓UV-B对苜蓿的光合伤害，增加苜蓿对UV-B辐照的抗性，而远红光辐照处理可以抵消掉红光的作用。

2.2 不同处理下紫花苜蓿光合色素的含量对比

由图2可知，与对照相比，UV-B、RL-DRL-UV 2组辐照处理中，紫花苜蓿的叶绿素a含量分别下降了18.83%、12.68%，差异均达到极显著水平（P<0.01）;叶绿素b含量分别下降了26.21%、15.51%，差异均达到极显著水平（P<0.01）;叶绿素a与叶绿素b的总含量分别下降了21.17%、13.43%，差异均达到极显著水平（P<0.01）。RL-UV处理后，与对照相比，叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a与叶绿素b总含量分别增加了4.5%、16.9%、8.47%，差异达极显著水平（P<0.01）。说明红光预照射后可以缓解由于UV-B辐照造成的叶绿素含量下降，远红光处理后，这种保护作用消失。

由图3可知，与对照相比，UV-B、RL-UV、RL-DRL-UV 3组辐照处理中，紫花苜蓿的类胡萝卜素含量均出现了极显著下降，分别下降了6.38%、5.68%、5.92%。类胡萝卜素含量排序依次为CK>RL-UV>RL-DRL-UV>UV-B，说明红光可以在一定程度上缓解UV-B对苜蓿幼苗中类胡萝卜素含量的影响。

2.3 不同处理下紫花苜蓿紫外吸收物质的含量对比

由图4可以看出，与对照相比，UV-B、RL-UV组的总酚含量都极显著增加，均为0.21 mg/g，均增加了5.2%;RL-DRL-UV组的总酚含量与对照相比极显著降低，为 0.19 mg/g，下降了5.5%。总酚含量排序依次为UV-B=RL-UV>CK>RL-DRL-UV。这说明UV-B可以提高总酚含量，红光预处理可以缓解总酚含量的上升。

由图5可以看出，与对照相比，UV-B、RL-UV组的类黄酮含量都极显著增加，分别增加了6.66%，6.11%;RL-DRL-UV组的类黄酮含量与对照相比下降了5.43%，差异达到极显著水平（P<0.01）。类黄酮含量排序依次为UV-B>RL-UV>CK>RL-DRL-UV。这说明UV-B辐照处理可以提高苜蓿幼苗中的类黄酮含量，红光预处理可以抑制类黄酮含量的上升。

2.4 不同处理对紫花苜蓿SOD、CAT活性的影响

由图6可知，与对照相比，UV-B、RL-UV组的SOD活性都极显著增加，分别增加了56.12%，73.71%;RL-DRL-UV组的SOD活性与对照相比仅升高了25.85%。紫花苜蓿SOD的活性排序依次为RL-UV>UV-B>RL-DRL-UV>CK。这说明UV-B可以提高SOD活性，红光预处理可以增加SOD活性的上升，远红光可以抑制红光对SOD活性的影响。

由图7可知，与对照相比，UV-B、RL-UV组的CAT活性都极显著增加，分别增加了142.86%，350.00%;RL-DRL-UV组的CAT活性与对照相比仅升高了21.43%。紫花苜蓿CAT活性排序依次为RL-UV>UV-B>RL-DRL-UV>CK。这说明 UV-B可以提高CAT活性，红光预处理可以加快CAT活性的上升，远红光处理可以抑制红光对CAT活性的影响。

3 讨论

3.1 红光预照射对苜蓿幼苗光合特性、光合色素的影响

植物的光合作用是其与环境长期进化的结果，能够适应环境，对植物生长发育具有十分重要的作用。光合色素在光合作用中具有捕捉、传递、利用光能的特点，与光合作用有着紧密关系。本研究中，与对照相比UV-B辐射导致紫花苜蓿光合特性和光合色素含量显著下降，而短期红光预辐射的光合速率，叶绿素、类胡萝卜素含量，总酚和类黄酮含量均介于对照组和UV-B处理组。这表明红光预辐射对植物具有一定的保护作用，能够减少UV-B辐射对紫花苜蓿的伤害。Biswal等在研究UV-B对豇豆子叶中光合作用机制活性的影响时，发现了短期红光（λmax=612 nm）对植物的保护效应，并假定是由于诱导了PhyB机制的形成：使用红光预辐射处理，则PhyB活性增大，进而提高植物抗UV-B辐射胁迫的能力[19]。本研究中，红光预辐照能够抑制苜蓿幼苗的光合特性和光合色素的下降，增强植物对UV-B辐射的抗性可能是由于光敏色素B参与维持叶片老化期间叶绿素水平和叶绿体结构的完整。

3.2 红光预照射对UV-B辐射下紫花苜蓿紫外吸收物质含量的影响

UV-B吸收物质通常是指在生物合成生命非必需物质并储存次生代谢产物过程中合成的部分非光合色素，它们可以保护叶片内部的细胞免受UV-B辐射的伤害。苯酚、类黄酮和花青素具有较强的UV-B吸收能力，增加其含量可以保护植物免受光损伤[20]。唐丽等发现，UV-B对植物生长有显著影响，尤其是抗氧化剂的影响，UV-B的辐射提高了植物体内类黄酮、总酚、花青素的含量[21-22]，这与本研究结果一致。可能是在UV-B胁迫下，幼苗生成许多的紫外吸收物质，这样不仅可以减少进到体内的UV-B的辐射净通量，而且也可以清除体内更多的多余自由基。朱新军发现，红光、激光分别与UV-B复合作用处理大豆，紫外吸收物质较单独UV-B处理低，而且发现单独红光、激光处理会使紫外吸收物质增加，猜测可能是由于激光能提高紫外吸收物合成酶的活性，从而增强植物防护能力[11]。本研究发现，UV-B辐射处理能够显著诱导紫花苜蓿体内总酚、类黄酮和花青素的合成，这与唐丽等的结果[21]一致，而在进行红光预辐射后紫外吸收物质的含量有所下降，若继续增加远红光的预辐射，则会显著降低紫外吸收物质的合成。这说明，红光可以减弱由UV-B辐照所引起的类黄酮物质含量的升高，也就是说红光在一定程度上激发了苜蓿的自我保护机制，从而抑制了 UV-B 对苜蓿的影响。笔者猜测，红光一方面通过控制类黄酮的生成量同时参加ROS清除过程减轻UV-B对苜蓿的损害;另一方面红光会提高UV-B吸收物合成酶的活性。

3.3 红光预照射对UV-B辐射下紫花苜蓿氧化酶活性的影响

植物在受到UV-B辐射后，会产生大量有毒害作用的活性氧和自由基，而植物体内存在着抗氧化酶系统，这些抗氧化酶的协同作用使自由基保持在低水平，避免膜损伤，从而达到保护细胞的目的[23]。本研究发现，UV-B辐射处理后，苜蓿叶中光合速率、气孔导度、蒸腾速率的减少伴随着SOD和CAT活性的增加，这与前人研究结果一致;用红光预辐射叶片后再照射UV-B，其SOD和CAT的活性比单独照射UV-B时更强，若在红光的预辐射后再增加远红光处理，则会部分消除红光对SOD和CAT活性的有益影响。有研究证实，在UV-B辐照的初始阶段，可能诱导SOD和CAT活性有所增加[24]。研究表明，在用增强UV-B处理芒果叶片时发现，在一定时间段内会导致成年叶片SOD、CAT、POD活性升高，并引起维生素C和还原型谷胱甘肽（GSH）的积累[25]。但是，Hui等發现高强度的UV-B辐射显著降低叶绿素荧光参数、叶绿素和类胡萝卜素含量和抗氧化酶活性[26]，这可能是由于强度过高，对细胞膜造成了伤害。朱新军预先用红光处理，然后UV-B辐射，发现植物SOD活性没有显著性差异[11]。但是有研究者发现，底物特别是酚类物质的强化合成，可以通过UV辐射和红光辐射来提高过氧化物酶活性[27]。也有研究发现植物体内的抗氧化酶在红光的照射下会被激活，但是该机制在许多方面还不清楚[5]。

有研究在莴苣种子萌发时，发现红光辐射后对种子萌发具有促进作用，随后远红光辐射处理后抑制莴苣种子萌发，造成对红光效应的逆转，为红光-远红光逆转效应，推测可能是存在一个能发生光逆转的光受体，或者相互拮抗的光受体[28-30]。有研究发现红光可以显著抑制黄绿豆下胚轴切割段的伸长，而远红光部分反转红光[31]。也有研究报道PhyB能够在远红光辐照下显著地促进拟南芥的黄化，这刚好与红光辐射后的效果相反[32]。本研究发现，红光能够对苜蓿的UV-B辐射起到一定的保护作用，远红光辐射后这种保护作用消失，再次印证了红光-远红光逆转效应。

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