钾营养调控烟草烟碱生物合成关键基因研究

李军营 晋艳 王俊 苏国兴

摘要：为明确钾营养供应对烟碱生物合成的影响规律，采用定量PCR和气相色谱-质谱联用法，研究不同供钾量条件下，烟草叶片烟碱含量和根系腐胺N-甲基转移酶（PMT）与喹啉酸磷酸核糖基转移酶（QPT）的表达情况。结果表明，低钾供应会增加烟叶的烟碱含量、促进根系PMT基因的表达;高钾供应对烟叶的烟碱合成和根系的PMT基因表达具有明显的抑制效应。低钾处理后再恢复正常钾供应水平，可显著降低由低钾供应对烟碱合成和PMT基因表达的促进作用。不同的供钾水平同样影响QPT基因的表达水平，但与烟碱积累量的变化不存在明显的相关性。因此，烟草植株的烟碱含量受供钾水平的影响，钾可能通过控制根系腐胺N-甲基转移酶基因的表达来影响烟叶中烟碱的积累。

关键词：烟草;钾营养;腐胺N-甲基转移酶;喹啉酸磷酸核糖基转移酶;烟碱;生物合成;关键基因相对表达量

中图分类号：S572.06   文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）16-0106-03

收稿日期：2018-05-07

基金項目：中国烟草总公司云南省公司资助项目（编号：2017YN06、2016YN05、2016YN28）。

作者简介：李军营（1978—），男，河北沧州人，博士，副研究员，主要从事烟草栽培研究。Tel：（0871）65106249;

通信作者：晋 艳，硕士，研究员，主要从事烟草栽培研究。Tel：（0871）65100188;

烟叶中的钾离子参与烟叶的生理生化反应，与烟株的抗逆性关系密切，对于烟草农业来说，它还影响着烟叶的内在品质和工业可用性，通常把钾含量作为衡量烟叶品质的重要指标[1]。钾对烟叶成熟度、香吃味、燃烧性、安全性等方面均有重要影响，钾含量越高，往往烟叶的质量越优[2]。在钾对烟碱积累的影响方面，不同学者的观点不一致。左天觉认为，钾对烟碱的积累几乎没有影响[3];胡国松等报道，高钾施用量增加了上部叶中的烟碱含量[4];舒海燕等研究了施钾对烟草农艺性状和烟碱含量的影响，结果发现，施钾可提高烟叶中钾含量，促进植株生长，降低烟叶中烟碱含量[5]。然而关于钾对烟碱合成的影响机制尚不清楚。Richards等研究表明，钾营养与植物腐胺的积累有关，缺钾可促进多种植物腐胺的积累[6-7]。由于腐胺是烟碱生物合成的前体物质，钾有可能通过腐胺影响烟叶烟碱的积累。为验证这个假设，本研究采用砂培法，以不同浓度的钾溶液处理烟草，并采用定量PCR技术和气相色谱-质谱联用法，分析不同供钾量对烟草烟碱含量和烟碱代谢关键酶腐胺N-甲基转移酶（PMT）、喹啉酸磷酸核糖基转移酶（QPT）基因相对表达量的影响。

1 材料与方法

1.1 材料处理

试验用烟草（Nicotiana tabacum L.）品种为K326，由云南省烟草农业科学研究院提供。试验于2015年在苏州大学的阳光房内进行，采用砂基培养法培育烟苗，蛭石和石英砂体积比为1 ∶1。烟草培育采用漂浮育苗法，培育至4叶期后，选取生长整齐的幼苗移入砂培塑料盆中。培育期间，昼温平均为26.5 ℃，夜温平均为18.3 ℃。在幼苗生长至8叶1心时，对烟株进行如下处理：（1）对照（CK）的培养液为1/2 Hoagland营养液（K+含量为0.23 mol/L）;（2）T1处理的培养液为1/2 Hoagland营养液中钾元素（K）稀释10倍;（3）T2处理的培养液为1/2 Hoagland营养液中K稀释50倍;（4）T3处理的培养液为1/2 Hoagland营养液中的K扩大5倍;（5）T4处理为恢复组，即T2处理10 d后，再在1/2 Hoagland营养液中恢复 10 d。由于Hoagland营养液中的K由KNO3提供，T1、T2处理因稀释导致的氮素损失用NaNO3补足，调节pH值至5.8±0.1，每隔2 d换1次营养液。每盆栽植2株烟草，各处理均设6组重复。随机选择长势均匀一致，没有发生病虫害的烟株，CK、T1、T2、T3分别在处理前及处理后10、20 d采集整株烟苗，T4在处理后直接取样，其中叶片用于烟碱含量测定，根系用于PMT基因和QPT基因的表达分析。

1.2 营养指标测定

将新鲜烟株用蒸馏水洗净，并用吸水纸吸干表面水分，分别称地上与地下部分质量，低温（-70 ℃）保存。

1.3 PMT和QPT定量PCR分析

取烟草根组织，在液氮中迅速研磨，采用Trizol-氯仿-异丙醇法[8]提取总RNA，并采用分光光度计与琼脂糖凝胶电泳对提取的总RNA进行检测。用DNase I在37 ℃下处理RNA提取样品20 min，以消除DNA干扰。将处理后的总RNA在65 ℃下变性5 min，向总体积为15 mL的总RNA反应混合液中加入1 mL随机引物（50 mmol/L）、4 mL 10 mmol/L dNTP，反应体系中二者浓度分别为2.5、2.0 mmol/L，迅速冰浴冷却。以提取获得的总RNA，合成cDNA的第1条链。向反应体系中加入4 mL 5×UltraScript RTase Buffer和1 mL UltraScript RTase Mix（含200 U/mL RTase，20 U/mL RNasin）后，在 30 ℃ 下预热10 min，52 ℃下孵育60 min，随后在70 ℃下灭活15 min，以降解逆转录酶。

用Primer Express software设计PCR引物，以烟草α-微管蛋白基因（GenBank登录号为J421411.1）为内参，该内参基因的引物为α-tublin-F：5′-GGAACCTTACAACAGTGTCCT-3′，α-tublin-R：5′-CAAACCTCAACGAGCAGCAAC-3′;PMT基因（GenBank登录号为D28506.1）的定量PCR引物为tPMT-F：5′-ACAGAGAATGGTGGATTTCC-3′，tPMT-R：5′-CGATTGAAGGATAACGAAGC-3′;QPT基因（GenBank登录号为AB038494.1）的定量PCR引物为tQPT-F：5′-CAGCAATAGCCACCAAGAATAC-3′，tQPT-R：5′-TGTCGCCTTACAAGTCACATC-3′。

上述所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。所用荧光染料为Thermo SBYR GREEN qPCR Master Mix（ROX included）。用两步法PCR扩增程序进行PCR扩增：50 ℃ 尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）预处理2 min，95 ℃预变性10 min;95 ℃变性15 s，60 ℃退火及延伸60 s，40个循环。数据采用2-ΔΔCT法[9]进行分析。

1.4 烟碱含量的测定

取烟草中部新鲜叶样，105 ℃杀青后，70～80 ℃烘干，过60目筛，取0.3 g（精确至0.000 1 g）试样，根据YC/T 383—2010[10]，使用气相色谱-质谱联用法，测定烟碱含量，所用气相色谱-质谱联用仪型号为7890B/5977A GCMS（美国Agilent公司），烟碱标准品购自SIGMA公司。

1.5 统计分析

所有数据均使用SPSS 21.0軟件经one-way ANOVA分析后，进行Duncans多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同供钾水平对烟株营养生长的影响

从图1可以看出，含不同浓度钾离子的营养液对烟草营养生长的影响存在显著差异。与对照相比，烟草地上部分与地下部分鲜质量均随钾供应水平的降低而减少。与对照相比，低钾水平T1处理和T2处理烟草的地上部分、地下部分鲜质量分别减少30.40%、37.64%和42.93%、57.03%，且对照与T1、T2处理间的差异达到显著水平。高钾水平T3处理烟草地上部分与地下部分的营养生长也显著低于对照。

由图2可知，随着钾离子浓度的恢复，地上部分和根系的营养生长可部分恢复。

2.2 不同供钾水平对烟草叶片烟碱积累的影响

由图3可知，在对照生长条件下，烟草叶片的烟碱含量随着植株的生长显著增加，与0 d相比，生长10、20 d后，烟碱含量分别增加24.17%、61.91%。

不同供钾水平对烟草叶片烟碱积累的影响如图4所示，随着钾离子浓度的降低，烟碱的积累量显著增加，处理后 10 d，T1、T2处理分别比对照显著增加3.60%、10.50%;而高钾水平T3处理对烟碱的积累则具有显著的抑制作用。对T2处理10 d后烟草进行钾恢复试验，结果发现，随着钾离子浓度的恢复，烟草叶片的烟碱含量随之减少，较恢复前降低 13.30%。不同供钾水平下烟草的烟碱积累量与溶液中的钾离子浓度呈明显负相关关系，即低钾水平会促使烟株大量积累烟碱，而高钾处理会抑制烟株体内烟碱的合成。

2.3 不同供钾水平对PMT、QPT基因表达的影响

2.3.1 不同供钾水平对PMT基因表达的影响

由图5可知，在生长前期，烟草植株有较高的PMT基因表达水平，且随着烟株的生长，表达量逐渐增强，不同测定时间之间的差异达显著水平。

由图6可知，处理后10 d，不同钾离子供应水平的营养液对烟草PMT基因的表达影响显著，随着钾离子浓度的降低，PMT基因表达水平显著升高，T1、T2处理分别比对照增加12.89%、18.93%，;相反，T3处理的PMT基因表达被显著抑制。对T2处理10 d后烟草进行钾恢复处理，结果发现，随着钾离子浓度的恢复，烟草根系中的PMT基因表达量显著下降，较恢复前下降37.37%。不同供钾水平下烟草根系中的PMT基因表达水平与胁迫溶液中的钾离子浓度呈明显负相关关系，即低钾水平会促进烟草根系PMT基因表达量的增加，而高钾处理会抑制PMT基因在烟草根系中的表达。

2.3.2 不同供钾水平对QPT基因表达的影响

由图7可知，在生长前期，烟草根系中的QPT基因表达量较高，随着烟株的生长，QPT表达量呈逐渐下降的趋势，表现出明显的表达时间特异性。图8为不同供钾水平对烟草根系喹啉酸磷酸核糖基转移酶基因表达的影响。与PMT基因不同，QPT基因的表达水平较低，且随着供钾水平的降低呈先升高后下降趋势，而5倍高钾处理与低钾处理相比对QPT基因表达量有一定程度的上调作用，但差异不显著。连续低钾（T2处理）胁迫20 d，根系中QPT基因的表达量达到最低值;对T2处理10 d后烟草进行钾恢复处理，结果发现，QPT基因表达量能基本恢复。

3 讨论

烟碱在烟草根中合成后，经木质部运输到叶片，贮存在液泡中[11-13]。由于烟叶烟碱含量约占其生物碱总量的90%，烟碱含量的高低影响着烟草的品质[14]。本研究结果表明，钾离子供应水平与烟叶烟碱的积累量呈负相关关系，提高钾离子浓度能有效降低烟草烟碱的积累量。同时还发现，钾离子供应水平与烟草根系中的PMT基因表达量呈负相关关系，即低钾会促进PMT基因的表达，使烟草大量积累烟碱，而较高的钾离子浓度，则会使PMT基因表达量下降， 进而降低烟碱

的积累量。研究后期QPT基因表达水平较低，说明钾可能不通过调控QPT基因的表达来调控烟碱类物质积累。钾供应水平与烟碱积累和PMT基因表达的这种调节关系，被低钾处理后的恢复试验结果进一步验证，随着供钾水平的恢复，PMT基因表达量下降，烟碱积累量随之减少。钾营养与植物的腐胺代谢有关[6-7]，而腐胺是烟碱生物合成关键酶PMT的作用底物，其可在底物水平上影响酶的活性，进而影响烟碱的积累。本研究结果表明，钾可能通过影响PMT基因的表达来影响烟碱的积累。至于钾调节PMT基因表达的机制尚需深入研究。

有关钾营养对烟碱积累的影响已有大量的报道，基本结论是土壤的供钾水平与烟株生长和烟叶烟碱含量关系密切，但对于供钾水平与烟碱含量确切关系的结论尚不统一[3-5]。

本研究结果显示，与对照相比，随着营养液中钾离子浓度的降低，烟株地上与地下部分的鲜质量随之降低，烟碱含量略有升高;钾离子浓度为对照组的5倍时，营养生长亦呈现下降趋势，烟碱含量略有下降，这可能是因为营养液中钾离子浓度过大时，会影响植株对其他离子的吸收，进而影响烟株的营养生长和烟碱的合成[15]。可见，低钾水平可促进烟叶中烟碱的合成，而高钾水平的作用则相反。

本研究发现，钾离子可能通过影响PMT基因的表达来影响烟草中烟碱的积累，前人鲜有报道。在生产实践中，本研究可为低钾土壤通过增施钾肥来调控烟碱含量和提高烟叶品质提供理论依据。

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