含多酶切位点融合黄色荧光蛋白的植物通用载体的构建与应用

匡琛 朱晓义 张亮 范世航 华玮

摘要：以植物表达载体pCAMBIA3301为基本骨架，以黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein，简称YFP）为标签蛋白构建可融合目标蛋白的表达载体，并包含可用于外源基因插入的单一识别位点的核酸酶酶切位点（Spe Ⅰ、Xba Ⅰ、Sma Ⅰ、BamH Ⅰ）。为了验证载体的实用性，将构建完成的载体转化到感受态GV3101农杆菌上，进行菌落PCR鉴定，再分别瞬时转化烟草下表皮和稳定转化拟南芥。激光共聚焦显微镜观察结果显示，在阳性转基因植株上均观察到荧光，在阴性对照上没有观察到荧光，表明YFP标签蛋白在转基因受体细胞中能够正常表达。pCAMBIA3301：：YFP载体的成功构建为植物蛋白亚细胞定位及过表达转基因植株等相关领域的研究提供了稳定可靠的通用型载体资源。

关键词：多酶切位点;黄色荧光蛋白;通用载体;激光共聚焦;植物基因表征工具

中图分类号： S188  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）16-0056-07

收稿日期：2018-04-04

基金项目：湖北省自然科学基金（编号：2015CFB348）;国家“863”计划（编号：2013AA102602）。

作者简介：匡 琛（1994—），男，湖南益阳人，硕士研究生，研究方向为功能基因组学与蛋白质组学。

通信作者：华 玮，博士，研究员，主要从事油菜功能基因组学研究。

植物表达载体是高等植物基因功能研究中不可或缺的工具，在后基因组时代具有广泛的应用[1]。植物表达载体可以用来研究启动子元件、蛋白质互作、亚细胞定位以及组成型表达。植物双元表达载体的发展和不同农杆菌菌株的选育，使得农杆菌介导的植物转化系统得到广泛应用[2]。早期的植物双元表达载体主要是由复制起始位点、2个T-DNA边界重复序列之间的部分、大肠杆菌筛选标记、目的基因与启动子元件及植物筛选标记组成的。植物表达载体的构建方法有传统的酶切连接法[3]和T-DNA插入法[4]。随着现代生物技术的发展，出现了多种新的技术，如Gateway法[5]、不依赖于基因序列和连接反应的不依赖序列和连接的克隆方法（sequence and ligation independent cloning，简称SLIC）[6]、重组融合PCR技术[7]、一步克隆法[8]、基于竞争性连接原理构建小片段基因表达载体技术[9]、无缝连接克隆In-Fusion技术[10]和快速克隆Golden Gate拼接法等[11]。综合比较上述几种载体构建的生物技术，基于SLIC原理的一步克隆方法具有操作简单、效率高、经济实惠及适用范围广等优点，被广泛应用到植物表达载体的构建中。

pCAMBIA系列双元表达载体是进行植物遗传转化最常用的表达载体之一，大多数植物功能基因组学研究所用的表达载体都以之为骨架[12-13]。植物表达骨架载体pCAMBIA3301所使用的报告基因是细菌的β-葡萄糖苷酸酶基因（β-glucuronidase，简称GUS）。虽然GUS蛋白相对较易检测，但是检测底物成本高，染色过程会损伤细胞的超微结构，从而对细胞造成一定毒害，并且反应中间物的扩散会影响葡萄糖苷酶本身在细胞内的准确定位[14]。基于GUS蛋白检测的局限性，目前发展了荧光蛋白标记技术[14]。与GUS蛋白相比，荧光蛋白的检测具有以下优点：（1）操作简单，在鉴定转基因植株时，只需取样制作临时切片，使用荧光显微镜观察有无荧光，省去了前处理等试验;（2）可以使用活体生物发光荧光成像系统进行活体检测;（3）对转基因植株的损伤较小，目前最常用的荧光蛋白是绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，简称GFP），它是从维多利亚水母中分离纯化出的一种可以发出绿色荧光的蛋白[15]。GFP生色基团的形成无种属特异性，GFP蛋白对细胞没有毒害作用，不会影响细胞的正常生长和功能[15]。以GFP作为选择标记基因，可以很方便地从大量细胞或组织中筛选出转化细胞和植株，并可追踪外源基因的分离或亚细胞定位。Sleight等利用Gibson法成功构建了Cyan-Megenta-Yellow表达载体，并插入启动子、终止子和核糖体结合位点等元件，从而编码青色荧光蛋白（CFP）、红色荧光蛋白（RFP）、黄色荧光蛋白（YFP）共3种荧光蛋白[16]。YFP是GFP的突變体，与GFP相比，YFP蛋白的荧光向红色光谱偏移。GFP的最大激发波长为395 nm，最大发射波长为509 nm，而YFP的最大激发波长为514 nm，最大发射波长为527 nm[17-18]。GFP在非模式植物如油菜中的表达不稳定，荧光强度弱，较难观察到荧光[19-20]。通过基因工程遗传转化引入YFP蛋白，较易观察到稳定的荧光，这可能是由于YFP存在更大的发射波长与激发波长。因此，在非模式植物的遗传转化中，YFP蛋白更具优势[20-21]。

基于SLIC技术的原理，可将插入片段PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点，称为一步克隆法，此技术的关键在于设计带有一步克隆酶切位点接头的引物序列，即在插入片段PCR引物的5′端引入线性化克隆载体末端序列，从而使插入片段PCR产物的5′端和3′端分别带有与载体2个末端对应的一致序列（15 bp左右）。本研究利用pCAMBIA3301：：GFP（为笔者所在实验室用pCambia3301、pAN580载体改造而来）作为基础载体。本研究用此方法构建了用于非模式植物的多酶切位点遗传转化通用载体pCAMBIA3301：：YFP。该载体在T-DNA右边界具有8个酶切位点，其中4个酶切位点（Spe Ⅰ、Xba Ⅰ、Sma Ⅰ和BamH Ⅰ）可用于插入目的基因，在T-DNA左边界具有10个可供选择的酶切位点，并且在CaMV 35S启动子的两端均有多克隆酶切位点，可以根据需要对启动子进行替换。本研究构建的多酶切位点融合黄色荧光蛋白通用载体，为研究植物基因功能提供了一种有力工具。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本试验均于2017年6月起由笔者于中国农业科学院油料作物研究所功能基因组实验室与农业农村部油料作物生物学与遗传育种重点实验室独立操作完成。双元表达载体骨架为pEarlyGate104和pCAMBIA3301：：GFP。笔者所在实验室中种植野生型烟草（tobacco）温室的培养条件如下：温度为 22 ℃，光—暗周期为16 h—8 h，光照度为 110 μmol/（m2·s），湿度约为30%。质粒提取试剂盒购自Axygen公司;凝胶回收试剂盒与大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α购自北京全式金生物技术有限公司;One Step Cloning Kit购自Vazyme公司;感受态农杆菌GV3101由笔者所在实验室保存。各种生化试剂和酶分别购自Sigma公司、Thermo Science公司和生工生物工程（上海）股份有限公司等。此外，根据美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，简称NCBI）网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）提供的YFP标签蛋白序列（登录号：KJ411637.1）设计本研究所用引物（表1）。

1.2 基因克隆

利用携带BamH Ⅰ、Bgl Ⅱ一步克隆酶切位点接头的YFP-F/YFP-R引物，以gateway104：：YFP载体为模板进行PCR扩增，获得带有相应一步克隆酶切位点接头的YFP序列。

采用KOD（超嗜热原始菌）菌株DNA聚合高保真酶 KOD-Plus-Neo进行PCR扩增。PCR扩增体系如下：10 μL 10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo，6 μL 2 mmol/L dNTPs，2 μL 25 mmol/L MgSO4，各2 μL引物F/R（均为10 μmol/L），8 μL模板，2 μL KOD-Plus-Neo（1 U/μL），68 μL高压灭菌蒸馏水。分装成4管，25 μL/管。PCR反应程序如下：94 ℃ 2 min;94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，35个循环。

1.3 载体连接重组、转化与菌落PCR初步鑒定

选择pCAMBIA3301：：GFP合适的克隆位点，并对克隆载体进行双酶切线性化。将扩增产物与线性化载体进行重组反应，融合YFP载体的反应体系如下：4 μL 5×CE Ⅱ Buffer（CE表示快速克隆酶），5 μL 线性化克隆载体（42 ng/μL），3 μL YFP扩增产物（60 ng/μL），2 μL重组酶Exnase Ⅱ，6 μL ddH2O。体系配制完成后，用移液枪上下轻轻吹打混匀，避免产生气泡。置于PCR仪中，于37 ℃反应30 min。待反应完成后，立即将反应管放置在冰水浴中冷却5 min。

将20 μL冷却的反应液加入200 μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30 min。于42 ℃热激45 s，然后于冰水浴孵育2 min。再加入450 μL LB液体培养基，于 37 ℃ 摇菌60 min。吸取菌液均匀涂布在含有卡那霉素（100 mg/L）的固体LB平板上，将平板倒置，于37 ℃过夜培养。

从培养箱中取出平板，在超净工作台中，使用无菌牙签挑取单克隆，于含有卡那霉素（100 mg/L）的固体LB平板上进行划线培养，编号标记并分别作为鉴定PCR反应体系的模板，PCR扩增，再进行电泳鉴定，观察凝胶成像情况。

1.4 测序鉴定

选择经PCR鉴定正确的菌株样品，随机从中挑取4个单克隆，将LB液体培养基与卡那霉素按体积比1 000 ∶1混匀，于37 ℃、200 r/min振荡培养12 h，送武汉擎科生物技术有限公司测序，获得测序结果后使用软件Vector NTI Advance 1153进行分析，判断是否存在突变。

1.5 农杆菌转化

根据测序结果选择序列正确的样品，使用Axygen质粒提取试剂盒提取质粒，采用液氮冻融法转化感受态农杆菌，在50 μL感受态农杆菌细胞中加入5 μL质粒（100 ng/μL），用移液枪吹打混匀后，放置于冰上5 min，再用液氮速冻1 min，于37 ℃水浴热激5 min，在超净工作台内加450 μL液态LB培养基，于28 ℃、200 r/min振荡培养4 h后涂布在含有卡那霉素（100 mg/L）、庆大霉素（50 mg/L）、利福平（100 mg/L）的三抗（下同）固体LB平板上，于28 ℃倒置培养48 h，挑取单菌落涂布在新的三抗固体LB平板上进行划线培养，并作为菌落鉴定体系的模板。

1.6 瞬时表达转化

在超净工作台上，用无菌牙签挑取鉴定正确的农杆菌菌株，加入含有三抗的液体LB培养基中，于28 ℃、200 r/min培养6 h左右，D260值达到1.0。此外，从笔者所在实验室 -80 ℃ 冰箱中取出保存的细胞核定位marker载体 Mecheery-marker和有助于共转化的载体p19，同时加入含有三抗的液体LB培养基中，于28 ℃、200 r/min摇床培养6 h左右，D260值也达到1.0。吸取样品、marker、p19三类载体菌液各2 mL，于12 000 g离心，弃上清，用转化工作液将菌体重悬制成悬浮液。10 mL转化工作液的配方如下：15 μL 100 mmol/L 乙酰丁香酮（AS），50 μL 0.2 mol/L 2-吗啉乙磺酸（MES），50 μL 2 mol/L MgCl2，用去离子水补充总体积到 10 mL。最终转化工作液由3种载体悬浮液按体积比 5 ∶3 ∶2 混合，即2 mL转化体系配制方法：分别吸取1 mL悬浮液样品，600 μL Mecheery-marker，400 μL p19，室温静置 2 h。选取野生型烟草4叶期的表面平整、肉质丰满的幼嫩叶片，用1 mL注射器将转化工作液通过物理压力沿着叶脉组织打入烟草叶片中，将烟草放置在温室中正常培养3 d，再取叶片进行激光共聚焦观察。

1.7 激光共聚焦观察

使用Nikon A1激光共聚焦平台，以注射器针孔为圆心，取面积为1 cm2的样品置于载玻片上，用2滴甘油封片并盖上盖玻片。按照标准探测模式（DU4）图像拍摄流程采集图像，并作相关数据分析，图像处理软件的版本为NIS-Elements AR 3.1。

1.8 稳定表达转化

与瞬时表达转化类似，取经菌落PCR鉴定正确的菌株，加入含有三抗的LB培养基中摇床过夜培养。采用Floral dip法转化Columbia野生型拟南芥[2]，转化工作液为200 mL水溶液体系，加入5%蔗糖及0.01%的Silwet L-77（一种有机硅表面活性剂）。待拟南芥生长到初花期（播种后约1个月），取出过夜培养至D260 nm为2.0左右的GV3101农杆菌菌株，室温、5 000 r/min离心15 min，再用转化工作液将农杆菌悬浮，直接将拟南芥花絮在转化工作液中浸泡1 min，处理后浇水覆膜暗处理24 h，光照培养7 d后，再根据同样的步骤转化处理1次。在温室中培养至T1代，取转基因拟南芥花瓣置于激光共聚焦显微镜下观察。

2 结果与分析

2.1 黄色荧光蛋白的克隆

利用携带BamH Ⅰ、Bgl Ⅱ一步克隆酶切位点接头的YFP-F/YFP-R引物，以pEarlyGate104：：YFP载体为模板进行PCR扩增，获得带有相应一步克隆酶切位点接头的黄色荧光蛋白序列，电泳结果见图1。

2.2 重组质粒电泳鉴定结果

采用BamH Ⅰ、Bgl Ⅱ双酶切植物表达载体p3301：：GFP，切胶回收酶切载体片段，通过一步克隆将骨架载体与YFP连接，并转化感受态DH5α，于含有卡那霉素的LB固体培养基上进行筛选，随机挑取单克隆进行PCR鉴定。由图2可以看出，1～10号菌株鉴定结果显示均有条带，表明黄色荧光蛋白已经被成功导入骨架载体中。由图3、图4可知，p3301：：YFP载体在黄色荧光蛋白标签上游有4个可用的常见限制性内切酶唯一识别位点：Spe Ⅰ、Xba Ⅰ、Sma Ⅰ、BamH Ⅰ，这4个常规的限制性内切酶识别位点在p3301：：YFP中均为单一拷贝，由此可任选2个酶切位点，设计带酶切位点接头的序列克隆目的基因，可以实现不同植物基因序列与黄色荧光蛋白基因序列的融合。

2.3 測序结果

对构建的重组质粒进行测序鉴定，测序峰图结果见图5，以NCBI网站提供的YFP标签蛋白序列（登录号：KJ411637.1）作为参考序列，使用软件Vector NTI Advance 11.5.3进行序列测定与拼接分析。由结果可知，YFP已被完整准确地连入p3301骨架载体中，从而成功构建出了p3301：：YFP载体。

2.4 酶切验证结果

为了验证p3301：：YFP载体酶切位点的可靠性，分别采用Spe Ⅰ/Bgl Ⅱ、Xba Ⅰ/Bgl Ⅱ、Sma Ⅰ/Bgl Ⅱ、BamH Ⅰ/Bgl Ⅱ双酶切p3301：：YFP载体，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测发现，可以获得大小为700 bp左右的YFP标签蛋白片段（图6），证明4个常见的限制性内切酶唯一识别位点（Spe Ⅰ、Xba Ⅰ、Sma Ⅰ、BamH Ⅰ）准确可靠。

2.5 瞬时表达转化结果

提取测序正确的p3301：：YFP载体质粒，转化GV3101感受态农杆菌，进行烟草瞬时表达转化，得到瞬时表达的烟草植株，进行烟草叶片激光共聚焦观察。为了便于区分荧光蛋白，在488 nm激光器通道下拍摄模式选择绿色，从而使得YFP激发光拍摄的图像显示为绿色（图7、图8）。激光共聚焦FITC（异硫氰酸荧光素）通道下观察到YFP激发光，表明标签蛋白YFP可以在植物体内进行组织泛表达;激光共聚焦 561 nm 激光器通道下观察到核定位mCherry红色荧光蛋白激发光，可以直接指明细胞核覆盖区域;激光共聚焦明场通道图像显示出植物细胞区域;通过FITC与TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明）双通道复合图像，能够观察到YFP与mCherry红色荧光蛋白可以共定位表达并在细胞核区域叠加显示黄色，表明YFP在烟草植株体内成功表达（图7）。

2.6 载体在转基因拟南芥组织细胞中的稳定表达

为了进一步研究载体p3301：：YFP在转基因植物组织中的稳定表达情况，本研究观察了转基因拟南芥花瓣周围细胞中黄色荧光蛋白的表达。在转p3301：：YFP拟南芥株系的花瓣等色素积累较少的器官中观察到强烈的荧光，而在野生型对照植株中均未观察到荧光，说明植物表达载体p3301：：YFP携带的YFP在模式植物拟南芥中能够整合并稳定表达（图8）。

3 讨论

植物功能蛋白与荧光蛋白的融合表达是研究功能蛋白在植物细胞体内定位及其运动特征的有力手段。绿色荧光蛋白由于能够自发产生荧光团，因此被广泛用作分子和细胞生物学的荧光标记。早期应用的野生型GFP基因具有一定不足，如GFP不仅具有2个激发峰，从而降低了检测特异性，而且其长波激发峰的强度较低，不易观察。在GFP所有的突变体中，黄色荧光蛋白具有最长的波长，在分子生物学和细胞生物学中可以用于构成有用的探针，因此YFP的应用范围更广。本研究将pAN580：：GFP载体中的GFP与p3301：：YFP载体中的YFP比对后发现，克隆的YFP相对于GFP有9个碱基发生突变，分别是第69位的G突变成A，第197、198位的AC突变成GG，第205位的G突变成C，第217、218位的AG突变成GC，第610、611位的AC突变成TA，第695位的A突变成T，从而导致5个氨基酸发生变化，分别是第66位的苏氨酸（ACC）突变成丙氨酸（GCC），第69位的缬氨酸（GTG）突变成亮氨酸（CTG），第73位的丝氨酸（AGC）突变成（GCC）丙氨酸，第204位的苏氨酸（ACC）突变成酪氨酸（TAC）以及第232位的组氨酸（CAC）突变成（CTC）亮氨酸。本研究用5个位点突变的YFP替换GFP基因片段，成功地构建了新型植物双元表达载体p3301：：YFP，其表达产物不需要其他底物或者辅助因子即可被检测。YFP替换GFP后荧光活性大大增强。本研究将p3301：：YFP载体进行瞬时转化和稳定转化的试验均观察到强烈的荧光，表明载体的高效可靠性。

用于遗传转化的植物表达载体需要质粒携带的目的基因与融合标记基因能够与宿主的染色体整合并表达[22-25]。高效的双元表达载体有利于高等植物基因的功能分析，如启动子分析[26]、基因沉默和蛋白质定位的荧光蛋白融合分析。如果多克隆位点中具有唯一的限制性酶切位点，将便于启动子的置换。遗传编码的荧光标签是蛋白质序列，可以融合到目的蛋白中使其激发荧光。在分子生物学研究中，植物表达载体资源远远少于动物、微生物载体资源，本研究构建的植物融合表达载体p3301：：YFP含有目的基因必需的启动子及终止子，同时含有4个可用常见限制性内切酶单一识别的位点，为外源目的基因引入提供了12种选择，具有更好的应用价值。此外，本研究通过接头引物PCR法[27]、基于SILC原理一步克隆等方法构建p3301：：YFP，与使用商业化T载体TOPO和gateway法构建植物表达载体相比，具有以下显著的优点：（1）操作简单，使用进口商业化载体前后需要经过2次细菌转化培养与菌落PCR鉴定，而通过本研究方法仅需1次;（2）成本较低，商业化TOPO载体费用较高，进口品牌昂贵，若使用 In-Fusion 技术构建表达载体，进口试剂盒极为昂贵，而本研究方法使用的国产品牌价格实惠，仅为进口试剂盒的1/10左右;（3）阳性率高，商业化TOPO载体假阳性率较高，容易出现目的基因5′端与3′端连反的现象，而本研究方法经过双酶切并不会出现连反现象。利用本研究方法构建的植物表达载体，具有广泛的应用价值。但是，本方法在目的基因两端加酶切接头时，可能导致引物退火温度偏高，从而影响特异性目的片段的获得，使得本方法在应用上具有一定的不足。

综上所述，本研究构建的多酶切位点融合黄色荧光蛋白通用载体，为研究人员提供了操作简单、效率高、经济实惠且适用范围广的亚细胞定位研究与功能分析工具。植物表达载体p3301：：YFP在启动子上游、多克隆位点、终止子下游分别有3、4、2个单一拷贝限制性内切酶识别位点。该载体可用于不同外源目的基因和不同蛋白功能表达载体的快速一步克隆构建，完成外源基因与宿主植株的瞬时转化，进行亚细胞定位，为植物的基因功能研究与遗传转化提供了新的通用型植物表达载体工具。

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