“红勋1号”红肉苹果多酚抗氧化与抗癌活性

齐娜 雷佳蕾 邓红 穆韦彤 刘旻昊 孟永宏 郭玉蓉

摘要在前期提取純化红肉苹果多酚及分析组成的基础上，通过3项抗氧化试验探讨多酚抗氧化能力，并用MTT法和荧光染色法研究多酚的抗癌活性。体外抗氧化试验结果表明，浓度为0.80 mg/mL红肉苹果多酚的总还原力与VC持平，0.60 mg/mL的多酚对ABTS+具有良好的清除作用（清除率94.11%），且对Cu2+/H2O2诱导的BSA蛋白氧化损伤具有明显的保护作用。MTT试验显示红肉苹果多酚对3种癌细胞（HepG2、Hela、A549）的增殖均有明显抑制作用（IC 50值分别为0.687、0.405、0.635 mg/mL），且对Hela癌细胞的抑制率最高达65.19%;台盼蓝染色、AO/EB及DAPI荧光染色试验发现，多酚浓度增大Hela细胞凋亡明显，且细胞内线粒体膜电位降低，活性氧水平升高，呈剂量依赖性。红肉苹果多酚具有良好的抗氧化活性，可显著诱导Hela细胞的凋亡，可作为天然抗氧化、抗癌食品基料进行深入开发利用。

关键词“红勋1号”红肉苹果;多酚;抗氧化活性;抗癌活性

中图分类号TS 201文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）18-0167-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.045

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Antioxidation and Anticancer Activity of Polyphenols from Red-flesh Apple of Hongxun No.1

QI Na， LEI Jia-lei， DENG Hong et al

（College of Food Engineering and Nutritional Science， Shaanxi Normal University， Xian， Shaanxi 710062）

AbstractBased on the extraction， purification and composition analysis of polyphenols from red-flesh apple， the antioxidant capacity of polyphenols from red-flesh apple was examined through three antioxidant test in vitro. The anticancer activity of polyphenols from red-flesh apple was determined by MTT assay and fluorescent staining mehods. The antioxidant test results in vitro showed that the total reducing power of polyphenols from red-flesh apple of 0.80 mg/mL， which was equal to VC， 0.60 mg/mL polyphenols had significant free radical-scavenging effect on the ABTS+ with clearances ratio of 94.11%. The polyphenols of red-flesh apple also had obvious protective effect for the oxidation damage of BSA protein induced by Cu2+/H2O2. The MTT assay experiments showed that the polyphenols had notable inhibitory capabilities on the cancer cells proliferation of Hela， HepG2 and A549 （ IC 50 of 0.405， 0.687 and 0.635 mg/mL， respectively）， and had highest inhibition rate of  65.19% on Hela cancer cells. Then the apoptosis phenomenon of Hela cells was distincted with the polyphenol concentration increased after Trypan blue， AO-EB and DAPI fluorescence staining and Hela cells apoptosis occurred in a dose-dependent manner， while intracellular mitochondrial membrane potential decreased and reactive oxygen species levels increased. The polyphenols from red-flesh apple displayed good antioxidant activity and could significantly induce the apoptosis of Hela cells， it will be used as an anti-cancer or/and natural anti-oxidation material in food industry for further development and utilization.

Key wordsRed-flesh apple of Hongxun No.1;Polyphenols;Antioxidation activity;Anticancer activity

我国是世界上最大的苹果栽培生产国，有丰富的苹果资源[1-2]，其中的新疆野苹果作为现代栽培苹果（Malus domestica Borkh.）的祖先种遗传多样性丰富、种质利用潜力大。红肉苹果（Malus sieversii f.neidzwetzkyana（Dieck）Langenf）是新疆野苹果[3]中的一种珍贵资源，果实外观独特，生物活性物质丰富，鲜果中多酚、果酸、类黄酮、Ca含量高，具有很好的营养保健特性[4]。

目前对红肉苹果的研究主要有遗传多样性[5-6]、类黄酮[7]、花青苷的组分含量[8-9]以及红色发育机理[10]等方面，其中王燕等[9]发现“紫红1号” 红肉苹果抗氧化能力是白肉苹果的7倍。刘羽等[4]研究了新疆3种品系红肉苹果果皮和果肉中的糖、酸、挥发性成分的组成与含量，评价其抗氧化能力。齐娜等[11]采用响应面法优化了超声辅助提取新疆“红勋1号”红肉苹果多酚（得率2.135 mg/g）的条件。Wang等[12]发现新疆红肉苹果的酚类物质具有很好的抗氧化能力，具有非常重要的食用与药用开发价值。

人类很多疾病的发生都与氧化应激密切相关，研究发现多酚可中断氧化反应链、清除自由基、淬灭单线态氧等防止氧化反应的发生，还能调控致癌过程中的关键酶等[13-14]。苹果是最重要的膳食多酚来源[15]，但不同品种苹果多酚由于结构含量的差异其活性不同。红肉苹果多酚具有极强的抗氧化活性，进而推断其有良好的抗癌活性，但是目前鲜见同时评价红肉苹果多酚抗氧化与抗癌活性的报道。

该研究在前期对多酚进行提取、纯化、组成分析的基础上，采用3项体外抗氧化试验明确新疆红肉苹果多酚的抗氧化能力;并用MTT法研究该多酚对3种癌细胞增殖的抑制效果，用荧光染色法探讨多酚对Hela细胞内线粒体膜电位和活性氧的影响，为红肉苹果多酚在功能食品等领域的应用提供数据。

1材料与方法

试验于2017年5—12月在陕西师范大学食品工程与营养科学学院进行。

1.1材料

“红勋1号”红肉苹果于2016年9月下旬苹果成熟季采自新疆塔城，大小均一、成熟度相同、无机械损伤和病虫害，摘后包装低温冷链运输，贮藏于1303实验室-18 ℃冰箱，待用。

试验所用的细胞株（HepG2、Hela、A549）、生化试剂（MTT、DMSO、DAPI）、试剂盒（活性氧检测、吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）、JC-1法线粒体膜电位检测）均与文献 [16]相同。

1.2设备与仪器

SB25-12DTDN超声波机、YHLGJ-10真空冷冻干燥机、Thermo高效液相色谱仪、Multiskan Go全波长酶标仪、ESCO生物安全柜、BG-verMINI迷你垂直电泳仪、CO2恒温培养箱、DMI3000B/DFC450C Leica倒置荧光显 微镜[16-17]。

1.3方法

1.3.1红肉苹果多酚的制备。提取红肉苹果多酚[11]，再纯化多酚[16]，分析其组成成分，并冷冻干燥纯化后的“红勋1号”红肉苹果多酚，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.3.2红肉苹果多酚的抗氧化活性。

1.3.2.1

红肉苹果多酚对ABTS+自由基的清除作用。分别以VC作为阳性对照，蒸馏水为阴性对照，制备多酚与ABTS+混合溶液[16]，测定吸光值，根据下式进行计算：

清除率=[AC-（ A-A0）]/ AC×100%（1）

式中，A为红肉苹果多酚溶液在734 nm的吸光值;AC为阴性对照组的吸光值;A0为本底的吸光值。

1.3.2.2红肉苹果多酚总还原力的测定。制备混匀液和测定吸光值[20]。以VC为阳性对照，70%的乙醇溶液作为本底对照，再根据下式进行计算：

吸光值=A-A0（2）

式中，A为红肉苹果多酚溶液在734 nm的吸光值;A0为本底的吸光值。

1.3.2.3

红肉苹果多酚对Cu2+/H2O2诱导BSA蛋白氧化损伤的保护作用。①变性[17];②依次进行制胶、上样、电泳、染色、脱色、图像分析[18]。

1.3.3红肉苹果多酚的抗癌活性。

1.3.3.1细胞的培养方法。进行细胞的复苏、传代、冻存[18-19]。

1.3.3.2

MTT法测定红肉苹果多酚对癌细胞增殖的抑制作用。分别培养人宫颈癌Hela细胞、肝癌HepG2细胞和肺癌A549细胞至对数生长期，进行MTT试验[18-19]，根据以下公式计算出癌细胞的存活率，存活率= 1-（空白对照组吸光 值-样品试验组吸光值）/空白对照组吸光值×100%。

1.3.3.3

台盼蓝染色。进行台盼蓝染色试验[19]，在倒置显微镜下观察各孔内细胞形态以及染色状态，并拍照记录。

1.3.3.4

AO/EB和DAPI荧光染色。进行AO和EB染色、DAPI染色[19]，放于倒置熒光显微镜下观察各孔内细胞的特征，并进行拍照保存。

1.3.3.5

Hela细胞线粒体膜电势的测定。用新疆红肉苹果多酚处理Hela细胞后[20]，吸掉培养液，用PBS清洗2遍后，按照试剂盒说明书进行操作，将处理好的样品立即放置于倒置荧光显微镜下观察细胞形态并拍照。

1.3.3.6

Hela细胞内活性氧（ROS）的测定。用新疆红肉苹果多酚处理Hela细胞后[20]，按照试剂盒说明书进行操作，同样将处理好的样品立即放置于倒置荧光显微镜下观察细胞形态并拍照。

1.4数据统计分析方法采用Design-Expert10.0及DPS软件处理数据。

2结果与分析

2.1红肉苹果多酚的抗氧化活性

新疆红肉苹果多酚对ABTS+自由基的清除作用如图1a所示，新疆红肉苹果多酚总还原力如图1b所示，新疆红肉苹果多酚对Cu2+/H2O2诱导BSA蛋白氧化损伤的保护作用如图1c所示。

从图1a可以看出，VC和新疆红肉苹果多酚均对ABTS+自由基具有很强的清除作用，并且表现出明显的剂量依赖性;当浓度达0.60 mg/mL时，多酚的清除率达94.11%（VC的清除率为93.30%），二者的清除能力基本相同。从图1b可以发现，VC和新疆红肉苹果多酚的还原能力都比较强，且有显著的剂量依赖性;当溶液浓度达0.80 mg/mL时，还原力逐渐趋于稳定，VC与红肉苹果多酚二者的还原力基本相同。

在生物体中·OH的量高于正常水平时，便会对生物大分子产生攻击，最终导致蛋白质的氧化损伤。而新疆红肉苹果多酚可对氧化损伤起到保护作用;作用越强，电泳条带颜色越深，则灰度值越大。从图1c可以看出，加入新疆红肉苹果多酚的电泳条带的灰度值均高于阴性对照（0 mg/mL），并且呈剂量依赖性，逐渐增大。当多酚浓度达3.2 mg/mL时，电泳条带灰度值高于空白组。该结果表明，新疆红肉苹果多酚对Cu2+/H2O2诱导BSA蛋白氧化损伤具有很强的保护作用，且表现出剂量依赖性。

2.2红肉苹果多酚的抗癌活性

2.2.1红肉苹果多酚的抗癌效果。

2.2.1.1

MTT试验结果。从图2a可以看出，新疆红肉苹果多酚对3种癌细胞的增殖均具有明显的抑制作用，并呈时间和浓度的依赖性，但是作用效果不同。多酚作用于3种癌细胞的IC 50值分别为0.405、0.687和0.635 mg/mL，对Hela细胞的抑制效果最为明显（细胞活力仅34.81%，抑制率65.19%）。由图2b可知，新疆红肉苹果多酚对Hela细胞作用6、12和 24 h时，均具有明显的抑制作用，且不同时间下IC 50值分别为0.635、0.405和0.360 mg/mL。根据抑制效果和时间经济，选择12 h为处理时间。

2.2.1.2

细胞染色试验结果。①台盼蓝染色。台盼蓝染色可快速区分活细胞和死细胞[21]。红肉苹果多酚对Hela细胞形态的影响如图3a所示，与无处理对照组（0 mg/mL）相比，红肉苹果多酚作用浓度为0.1 mg/mL时，可以观察出已经有部分Hela细胞开始发生明显的变化（皱缩、变小变圆、间隙逐渐增大），有少量细胞被染成蓝色;随着多酚浓度增加达 0.5 mg/mL时，细胞大部分发生皱缩凋亡现象，被染成蓝色，基本失去原来的形态，且呈剂量依赖性。②荧光染色。吖啶橙（AO）在激发光下发出绿色荧光;溴化乙锭（EB）仅能与受损的细胞结合，在激发光下发出橘红色荧光[22]。如图3b所示，将不同浓度的新疆红肉苹果多酚作用于Hela细胞12 h后，对照组（0 mg/mL）Hela正常活细胞呈现均匀绿色荧光，多酚作用浓度为0.1 mg/mL时，Hela细胞核染色质发生明显固缩，细胞有逐渐变红的趋势（早期凋亡细胞），个别细胞完全呈橘红色（晚期凋亡细胞）;随着多酚浓度的增大，被染成橘红色细胞的数量也增多。DAPI（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）荧光染色结果如图3c所示，对照组（0 mg/mL）中的Hela细胞内部荧光染色均匀，当新疆红肉苹果多酚作用浓度为 0.1 mg/mL时，细胞形态发生变化，有个别细胞出现明显的亮斑（细胞开始发生凋亡），当多酚浓度增加时，细胞亮斑的数量越来越多，凋亡现象也越来越明显。这些显著特征可以证明新疆红肉苹果多酚可有效诱导Hela细胞发生凋亡，并与其剂量呈正相关。

2.2.2红肉苹果多酚的抗癌机制。

2.2.2.1

红肉苹果多酚对细胞线粒体膜电位的影响。线粒体膜电位是一种反映细胞受损效应较灵敏的指标，当细胞发生凋亡时，线粒体功能发生紊乱，膜电位便发生变化[23]。采用JC-1荧光探针[24]测定细胞内线粒体膜电位的变化（图4），与对照组（橘红色荧光，膜电位高）相比，红肉苹果多酚可以明显增强Hela细胞内绿色的荧光，当浓度达0.5 mg/mL时，细胞内几乎完全呈现绿色荧光，说明膜电位低，而线粒体膜电位的下降是细胞早期凋亡的重要现象;细胞凋亡时由于线粒体膜巨型通道PT孔开启，使得线粒体膜的通透性增大，膜两侧的离子重新分布，造成线粒体膜电位的迅速下降，所以线粒体膜电位的降低与细胞凋亡水平有密切关系。图4显示红肉苹果多酚可导致Hela细胞线粒体损伤和功能障碍，可显著降低线粒体膜电位，且呈剂量依赖性。

2.2.2.2

红肉苹果多酚对活性氧生成的影响。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一种活泼的含氧化合物，过量的ROS可以激活细胞发生凋亡，可选择药物诱导细胞中ROS发生变化以抑制肿瘤细胞[25]。采用DCFH-DA荧光探针法测定了不同浓度的新疆红肉苹果多酚对细胞内ROS水平的影响（图5）。DCFH-DA（无荧光）能够穿过细胞膜被水解成DCFH，在细胞氧化剂作用下DCFH生成具有荧光的DCF，可根据荧光强度来反映细胞内ROS水平的高低。如图5所示，和对照组（0 mg/mL）相比，红肉苹果多酚（0.5 mg/mL）处理过的Hela细胞的荧光显著增强，且呈剂量相关性，说明红肉苹果多酚能刺激Hela细胞产生ROS，可能会减弱Hela细胞线粒体抗氧化防御机制，使线粒体活性氧产生增多，這与线粒体膜电位降低一致。

3结论

“红勋1号”红肉苹果多酚对ABTS+自由基的清除作用与VC相当，同时该多酚具有较高的总还原力，对Cu2+/H2O2诱导BSA蛋白氧化损伤具有良好的保护作用。此外，红肉苹果多酚能够有效抑制3种癌细胞（Hela、A549、HepG2）的增殖，且呈剂量依赖性;对Hela细胞抑制最为明显（IC 50值为 0.405 mg/mL）。台盼蓝染色、AO/EB及DAPI荧光染色发现红肉苹果多酚处理后的Hela细胞发生明显的凋亡，因为该多酚能够降低Hela细胞线粒体膜电位，改变线粒体通透性，进而使细胞功能受损，发生凋亡，同时刺激Hela细胞中ROS的生成，发生氧化应激，诱导Hela细胞凋亡。

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