枯草芽孢杆菌Yz菌株发酵原粉丸化种衣剂与化学药剂复配剂的研制

罗振亚 林开春 徐淑

摘要[目的]篩选可与枯草芽孢杆菌Yz菌株联用的化学药剂及复配比例，以提高枯草芽孢杆菌Yz菌株对棉花立枯病的防治效果。[方法]采用稀释平板计数法，测定Yz菌株发酵原粉中活菌数，比较不同化学药剂与Yz菌的生物相容性;采用盆栽试验，测定复配种衣剂对棉花立枯病的防效以及对棉花种子发芽率的影响。[结果]甲基托布津、扑海因、百菌清、多菌灵对Yz菌芽孢活性具有保护作用，活芽孢下降率分别为39.70%、39.99%、46.33%、50.42%，显著低于对照;多抗霉素和代森锰锌对Yz菌芽孢活性无影响，活芽孢下降率与对照无显著差异;可用来与Yz丸化种衣剂进行复配。盆栽试验表明，Yz丸化种衣剂与代森锰锌、多菌灵、甲基托布津复配后，棉花种子发芽率较高，为85.00%～94.98%，对棉花立枯病的防效也提高，为63.99%～71.37%。其中，甲基托布津以0.3%和0.5%的比例与Yz丸化种衣剂混配效果最好，防效分别为74.42%、76.58%。[结论]甲基托布津与Yz丸化种衣剂复配效果较好，以0.3%比例复配最佳。

关键词枯草芽孢杆菌;棉花立枯病;丸化种衣剂;复配;化学药剂

中图分类号S 435.621文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）18-0143-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.038

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Development of Compound Agents for Seed Pelleting Agent of the Fermentation Powder of Bacillus subtilis Yz Strain and Pesticide

LUO Zhen-ya1，LIN Kai-chun2，XU Shu1 （1.Plant Protection Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection，Guangzhou，Guangdong 510640;2.College of Plant Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan，Hubei 430070）

Abstract[Objective]To improve the control effect of the fermentation powder of Bacillus subtilis Yz strain on cotton damping-off by screening out pesticide and ratio combined with bacillus subtilis Yz strain.[Method]The number of viable bacteria in fermentation powder of Yz strain was determined by dilution plate counting method to determine the biocompatibility of pesticide and Yz.Pot experiments was conducted to determine the effect of compound seed coating agent on cotton damping-off and germination rate of cotton seeds.[Result] The include thiophanate-methyl，iprodione，chlorothalonil，carbendazim had protective effects on the spore activity of Yz bacteria，and the reduction rate of live spore was 39.70%，39.99%，46.33% and 50.42%，respectively，which was significantly lower than that of the control group.Polyoxin and mancozeb had no effect on the spore activity of Yz bacteria，and the reduction rate of live spore was not significantly different from that of the control group.The pesticides stated above can be used to compound with Yz seed coating agent.Pot experiments showed that when pelleting seed-coating agent of Yz was compound with mancozeb，carbendazim，thiophanate-methyl，the cotton had higher germination rate （85.00% to 94.98%） and lower incidence of cotton damping-off （the control effect was 63.99% to 71.37%）.In addition，the mixtures of thiophanate-methyl and Yz pelleting seed-coating agent with the ratio of 0.3% and 0.5% had the best control effect，which was 74.42% and 76.58%，respectively.[Conclusion]The mixture of thiophanate-methyl and Yz pelleting seed-coating agent had the most obvious effect，and the best compound proportion was 0.3%.

Key wordsBacillus subtilis;Cotton damping-off;Pill seed coating agent;Compound;Pesticide

棉花立枯病又称烂根、黑根病，主要由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）侵染引起[1-2]，以种子和土壤为传播媒介，在棉花幼苗期发生普遍，可造成大量烂种、烂根和弱苗以及棉花生长发育迟缓，甚至严重影响棉花的产量和品质[3-4]。防治棉花立枯病的方法主要有药剂浸种、药剂拌种、苗期喷药、温汤浸种、深耕冬灌、轮作等[5]，其中药剂拌种是目前最常用的方法。种衣剂具有保护种子、提高出苗率、防治病虫害、促进作物生长、增强抗逆性等作用[6-9]，并可以减少农药的使用，降低病原菌和害虫产生抗药性的风险[10]。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是防治植物病害的一种有效生防菌，抑菌范围较广泛[11-12]，其突出特征为生长速度快、营养简单、耐热抗逆性强且有利于生防菌的加工生产[13-14]。国外已有多个菌株获得商品化生产许可，如GBO3、MBI600、QST713[15]和解淀粉枯草芽孢杆菌变种FZB24[16]，我国成功开发的制剂有百抗、麦丰宁、纹曲宁、萎菌净、亚宝等[17-18]。

生防菌虽低毒、绿色环保，但易受环境、气候、定殖能力等的影响，存在大田防效差、显效慢等特点。目前，生物与化学相结合的病虫害防治策略既能有效控制病虫害，又能降低化学农药使用量，受到各国植物保护专家的重视[19]。在前期研究工作中，已从土壤中分离筛选到一株對棉花苗期病害有抑制活性的枯草芽孢杆菌Yz菌株，并研制出其丸化种衣剂配方，经盆栽试验证明其对棉花立枯病具有较好的防病作用。因此，笔者筛选可与枯草芽孢杆菌Yz菌株联用的化学药剂并进行复配，以期为生防制剂的开发提供技术支持，为棉花立枯病的可持续防治提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试棉花品种。鄂棉23号（裸种），由武汉市农业科学院提供;鄂棉23号（10%拌种灵和福美双悬浮种衣剂包衣），市售。

1.1.2病原指示菌以及活性菌株。

供试菌株：棉花立枯病原菌（Rhizoctonia solani kuhn），由武汉天惠生物工程有限公司提供。枯草芽孢杆菌Yz菌剂发酵原粉（Bacillus subtilis），由武汉天惠生物工程有限公司提供。

1.1.3供试药剂。

枯草芽孢杆菌Yz菌株发酵原粉丸化种衣剂配方（以下简称Yz丸化种衣剂）：硅藻土：羧甲基纤维素钠：木质素磺酸钠：Yz=6 g：1.6 g：0.2 g：2 g。化学药剂：50%多菌灵超微可湿性粉剂（山西临汾有机化工厂）、70%代森锰锌可湿性粉剂（美国巨邦农资国际贸易公司）、75%百菌清可湿性粉剂（利民化工有限责任公司）、15%三唑酮可湿性粉剂（四川化学工业研究设计院）、50%扑海因可湿性粉剂（安万特作物科学公司）、97%甲基托布津原药（山东华阳科技股份有限公司）、1.5%多抗霉素可湿性粉剂（吉林延边春蕾生物药业有限公司）。

1.2试验方法

1.2.1化学杀菌剂的筛选。

将待筛选的化学杀菌剂与Yz原粉按1∶1（W/W）的比例混合均匀，密封储藏于（54±2）℃恒温箱中14 d，以未处理的Yz原粉为对照，无菌水为空白对照，采用稀释平板计数法测定其菌数，通过测定菌数的下降率来判断化学杀菌剂对Yz原粉生物活性的影响。选出对Yz原粉活性影响较小甚至有保护作用的化学杀菌剂，进一步通过棉花盆栽试验筛选出与Yz原粉复配效果最好的化学药剂和最佳用量。

1.2.2棉花盆栽试验。

棉种经过硫酸脱绒后加稀碱溶液水洗至pH 7左右后，精选饱满的种子。将化学药剂与枯草芽孢杆菌Yz菌株发酵原粉丸化种衣剂复配，然后进行棉花种子包衣处理。化学药剂的量设置3个比例，分别为包衣种子重量的0.1%、0.3%、0.5%。棉花种子包衣后播于接入棉花立枯病菌的无菌沙（一根试管斜面病菌菌种接500 g无菌沙）中。无菌沙以塑料小碗分装，每碗装土300 g，每碗播15粒种子，放置于华中农业大学农药研究室网室中。每处理4次重复。并分别设接种棉花立枯病（病CK）和不接种棉花立枯病（空CK）的空白对照以及鄂棉23号（市售）处理，出苗后5～ 7 d调查出苗率和棉苗发病情况。

发芽率 =（出苗株数/种子总数）×100%

病情指数=（各级病株数×各级代表值）/（调查总株 数×9）×100

防治效果=[（空白对照区病情指数-处理区病情指数）/空白对照区病情指数]×100%

立枯病病情分级标准：0级，全株无病;1级，根部病斑占整个根部面积的10%以下;3级，根部病斑占整个根部面积的11%～25%;5级，根部病斑占整个根部面积的26%～50%;7级，根部病斑占整个根部面积的51%～75%;9级，根部病斑占整个根部面积的76%以上。

1.3数据分析采用Microsoft Excel（2007版）软件对试验数据进行分析和绘图，平均数采用Duncan法进行多重比较，显著水平P=0.05。

2结果与分析

2.1化学药剂对Yz原粉活芽孢的影响

由图1可知，经 54 ℃恒温处理14 d后，未添加化学药剂的Yz原粉活芽孢下降率为68.47%。添加化学药剂甲基托布津、多菌灵、代森锰锌、扑海因、百菌清、多抗霉素、三唑酮后，Yz原粉活芽孢下降率分别为39.70%、50.42%、68.11%、39.99%、46.33%、61.80%、78.43%。添加甲基托布津、扑海因、百菌清、多菌灵的Yz原粉活芽孢下降率显著低于空白对照（P>0.05）;添加多抗霉素和代森锰锌的Yz原粉活芽孢下降率与空白对照相当，无显著差异（P<0.05）;添加三唑酮的Yz原粉活芽孢下降率显著高于空白对照（P>0.05）。

2.2Yz丸化种衣剂与化学药剂复配剂对棉花种子发芽率及棉花立枯病防治效果的影响

2.2.1棉花种子发芽率。

将50%多菌灵、70%代森锰锌、甲基托布津原药、75%百菌清、1.5%多抗霉素、50%扑海因6种化学药剂分别按一定比例混入Yz丸化种衣剂配方中（各化学药剂的量均为包衣种子重量的0.3%）。结果表明（表1），甲基托布津、多菌灵、代森锰锌、扑海因、百菌清、多抗霉素6种药剂与Yz丸化种衣剂混配后，棉花种子发芽率分别为 88.30%、94.98%、85.00%、 71.68%、81.68%、70.00%。多菌灵+Yz处理的棉花种子发芽率显著高于其他几个药剂处理，甲基托布津+Yz、代森锰锌处理次之，扑海因+Yz和多抗霉素+Yz处理的棉花种子发芽率显著低于其他处理。

2.2.2棉花立枯病防治效果。

由表1可知，甲基托布津、多菌灵、代森锰锌、扑海因、百菌清、多抗霉素6种药剂与Yz丸化种衣剂混配后，对棉花立枯病的防治效果分别为 71.37%、66.52%、63.99%、 46.01%、30.45%、28.42%。甲基托布津+Yz处理对棉花立枯病的防效最高，但与市售的鄂棉23号和多菌灵+Yz处理的防效均相当，无显著差异;扑海因+Yz与Yz处理对棉花立枯病的防效相当，而百菌清+Yz和多抗霉素+Yz处理对棉花立枯病的防效相对较差，显著低于其他处理。

2.3Yz丸化种衣剂复配化学药剂的筛选与优化

根据以上试验结果，选择甲基托布津、多菌灵和代森锰锌与Yz丸化种衣剂进行复配。3种药剂与Yz丸化种衣剂复配的用量见表2。结果表明，3种药剂不同剂量与Yz丸化种衣剂复配后，棉花种子发芽率可达83.33%～93.35%，与对照无显著差异。多菌灵含量为 0.1%、0.3%和0.5% 3个处理对棉花立枯病的防治效果分别为66.17%、71.80%、72.69%;代森锰锌含量为 0.1%、0.3%和0.5%3个处理对棉花立枯病的防治效果分别为53.82%、68.37%、68.28%;甲基托布津含量为0.1%、0.3%和 0.5%3个处理对棉花立枯病的防治效果分别为 57.02%、 74.42%、76.58%。甲基托布津含量为 0.3%和0.5%的处理对棉花立枯病的防效较高，其次为多菌灵含量为0.3%和0.5%的处理，接着为代森锰锌含量为0.3%和0.5%的处理以及多菌灵含量为0.1%的处理，而代森锰锌含量为0.1%、甲基托布津含量为0.1%处理的防效则较差（表3）。

综合以上结果，甲基托布津原药（0.3%和0.5%）与Yz丸化种衣剂的混配效果最佳，从环保和防效综合因素考虑选择甲基托布津原药0.3%的处理。最终配方为硅藻土：羧甲基纤维素钠∶木质素磺酸钠∶Yz∶甲基托布津原药=6 g∶1.6 g∶ 0.2 g∶2 g∶0.092 g。

3结论与讨论

生防微生物和化学药剂协同防治植物病害是进行安全无害化、环境友好型防治的重要举措[20]。通过该举措，可达到防效提高、化学药剂用量减少、优势互补等效果。广东省植物保护新技术重点实验室自主研制的枯草芽孢杆菌Yz菌株丸化种衣剂对盆栽苗棉花立枯病具有较好的防效，但在田间其防效则较不稳定。该研究筛选了几种可与Yz菌株丸化种衣剂联用的化学药剂，并进行复配。结果表明，甲基托布津、扑海因、百菌清、多菌灵对Yz菌株原粉芽孢活性具有保护作用，多抗霉素和代森锰锌对Yz原粉芽孢活性无影响，而三唑酮对Yz原粉芽孢活性则有明显的抑制作用。因此，甲基托布津、扑海因、百菌清、多菌灵、多抗霉素和代森锰锌与Yz菌的相容性较好，可用来与Yz丸化种衣剂进行复配。盆栽试验结果表明，扑海因、百菌清和多抗霉素添加到Yz丸化种衣剂后，棉苗的发芽率相对较低，而棉花立枯病的发病率则相对较高。因此最终选择甲基托布津、多菌灵和代森锰锌与Yz丸化种衣剂进行复配。

化学药剂有助于生防微生物能够顺利地在各种土壤生态环境中定殖、繁殖，并形成优势种群，从而更好地发挥生物防治作用[21-24]。该研究结果表明，将甲基托布津、多菌灵和代森锰锌与Yz丸化种衣剂进行复配后，棉花种子发芽率为85.00%～94.98%，与对照无显著差异;复配剂对棉花立枯病的抑制有明显的增效作用，其中甲基托布津按0.3%和0.5%的比例与Yz丸化种衣剂复配时增效作用最明显，防效分别为74.42%、76.58%，显著高于对照，可选用甲基托布津与Yz菌株丸化种衣剂按0.3：100的比例复配进一步进行田间防病试验，确定防治效果。

生防菌和化学药剂协同防治综合了生防菌和化学杀菌剂的优点，可弥补生防菌抑菌效果慢、田间防效不稳定的缺点，从而为菌剂更好的开发利用提供指导作用[25]。该研究也证實了这一点，但关于枯草芽孢杆菌Yz菌株与化学药剂甲基托布津的协同增效作用机制，枯草芽孢杆菌Yz菌株在棉苗中的残留消解动态，质保期及使用规范还有待于进一步研究。

参考文献

[1]张亚平，李国英，阎小雪.北疆棉花苗期病害拮抗菌7B-1的研究[J].中国农业科学，2002，35（6）：28-731.

[2]邓之亮，杨新东，姜莉莉.8种杀菌剂对棉花立枯丝核菌的室内毒力测定[J].世界农药，2015，37（3）：58-59，61.

[3]AMOUSTAFA-MAHMOUD S M，SUMNER D R，RAGAB M M.Interaetion of fung-ieides herbieides and planting date with seedling disease of cotton caused by rhizoetonia solani AG-4[J].Plant disease，1993，77（1）：79-86.

[4]刘书民.吡虫啉悬浮种衣剂防治棉花蚜虫田间药效试验初报[J].安徽農学通报，2011，17（24）：59-60.

[5]师勇强，冯自力，李志芳，等.7种杀菌剂处理棉花种子防治苗期立枯病的效果[J].江苏农业科学，2015，43（9）：146-148.

[6]雷斌，李进，段留生，等.种衣剂对低温处理下棉花胚根及幼苗外部形态和超微结构的影响[J].中国农业气象，2017，38（4）：248-256.

[7]刘铜，申永强，刘震，等.3种种衣剂对芸豆根腐病的防治效果[J].植物保护，2017，43（2）：216-219.

[8]任美凤，陆俊姣，李大琪，等.2 种种衣剂对小地老虎幼虫的毒力测定及保苗效果[J].中国植保导刊，2017，37（4）：68-70.

[9]崔文艳，何鹏飞，何朋杰，等.微生物复合种衣剂对玉米发芽、苗期生理特性及产量的影响[J].云南农业大学学报（自然科学），2016，31（4）：630-636.

[10]陈丽华，何鹏飞，袁德超，等.一种防治棉花黄萎病的生物复合种衣剂的研制[J].棉花学报，2018，30（3）：282-290.

[11]孟兆禄.Bacillus Cereus B-02拮抗作用相关基因的克隆及其表达[D].淄博：山东理工大学，2009.

[12]杨洪凤，薛雅蓉，余向阳，等.内生解淀粉芽孢杆菌 CC09 菌株在小麦叶部的定殖能力及其防治白粉病效果研究[J].中国生物防治学报，2014，30（4）：481-488.

[13]ELLIOTT M L，DES JARDIN E A，BATSON W E JR，et al.Viability and stability of biological control agents on cotton and snap bean seeds[J].Pest management science，2001，57（8）：695-706.

[14]揣红运，谢学文，石延霞，等.枯草芽胞杆菌微粉剂的研制及其对黄瓜白粉病的防治效果[J/OL].植物病理学报，2019-01-07[2019-03-13].https：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.2184.Q.20190107.0721.002.html.doi.org/10.13926/j.cnki.apps.0003871.

[15]United States Environmental Protection Agency.Office of pesticide program：Biopesticide [DB/OL].[2017 -12 -23].http：//www.epa.gov/pesticides/biopesticides.

[16]黄曦，许兰兰，黄荣韶，等.枯草芽孢杆菌在抑制植物病原菌中的研究进展[J].生物技术通报，2010（1）：24-29.

[17]杜锦锦.生防菌株BAB-1芽胞耐热及灰霉菌对其抗性风险研究[D].保定：河北农业大学，2013.

[18]毕方铖，黄泽鹏，孟祥春.枯草芽孢杆菌Bs01发酵条件的优化及对胶孢炭疽菌的抑制[J].保鲜与加工，2019，19（1）：37-45.

[19]尤春梅，高汝佳，黄沈鑫，等.生物农药与化学农药复配对桃枝枯病菌的毒力[J].安徽农业科学，2016，44（15）：152-154.

[20]黄小琴，刘勇，张蕾，等.烟草青枯病生防芽孢杆菌协同防治药剂的筛选和复配[J].农药，2015，54（11）：848-851.

[21]KLOEPPER J W，LEONG J，TEINTZE M，et al.Enhanced plant growth by siderophores produced by plant growth-promoting rhizobacteria[J].Nature，1980，286：885-886.

[22]WELLER D M.Biological control of soilborne plant pathogens in the rhizosphere with bacteria [J].Annual review of phytopathology，1988，26：379-407.

[23]陈志谊，刘永锋，陆凡.井冈霉素和生防菌Bs-916协同控病作用及增效机理[J].植物保护学报，2003，30（4）：429-434.

[24]刘邮洲，陈志谊，刘永锋，等.枯草芽孢杆菌sf628和咪鲜胺锰盐协同作用防治番茄枯萎病[J].江苏农业学报，2011，27（6）：1249-1253.

[25]谷春艳，王学峰，苏贤岩，等.解淀粉芽孢杆菌WH1G与氟啶胺协同防治草莓灰霉病[J].农药，2017，56（12）：932-936.