马铃薯疮痂病链霉新变种的分离与生物学特性分析

马建荣 余永红 黎敬鸿 陈力畅 何海林

摘要[目的]研究土壤中分離到C9菌株的种类归属和生物学特性。[方法]扩增C9菌株的16S rDNA序列，并进行系统发育建树。检测C9菌株对不同碳源、氮源的利用能力，以及对不同抗生素、渗透压的敏感性。利用GC-MS法测定C9菌株的脂肪酸组分，并扩增其脂肪酸合成关键酶——3-酮脂酰ACP合成酶III（FabH）编码基因，并进行序列同源性分析。[结果]基于C9菌株的16S rDNA序列分析，结合分析其菌落形态特征，初步判断C9菌株为马铃薯疮痂病链霉菌（Streptomyces scabies）。但C9菌株的生理生化特征与已报道的S.scabies菌株有明显差异，进一步盆栽试验结果显示C9菌株不能引起马铃薯疮痂病，其染色体上也没有扩增获得致病岛（PAI）区域中致病性相关的基因，说明该菌株不具有马铃薯疮痂病致病性，为Streptomyces scabies的一个新变种。C9菌株的脂肪酸组成测定结果显示其主要合成棕榈油酸（C 16∶1）和棕榈酸（C 16∶0），其不饱和脂肪酸总含量达36.2%，也符合马铃薯疮痂病非致病株的特征。C9菌株基因组中fabH基因序列和编码的氨基酸序列与Streptomyces scabies都具有极高的一致性。[结论]C9菌株为马铃薯疮痂病链霉菌新变种。C9菌株为进一步深入研究马铃薯疮痂病链霉菌的基础代谢机制或探索其致病机理提供了良好的材料。

关键词马铃薯疮痂病链霉菌; 16S rDNA; 脂肪酸组成

中图分类号S 182;Q 93文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）18-0139-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.037

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Isolation and Biological Characteristics Analysis of a New Variety of Streptomyces Potato Scab

MA Jian-rong，YU Yong-hong，LI Jing-hong et al （Guangdong Food and Vocational College，Guangzhou，Guangdong 510520）

Abstract[Objective]To study the biological characteristics and classify the C9 strain isolated from soil.[Method]The 16S rDNA sequence of the C9 strain was amplified and phylogenetical tree was established.The ability of C9 strain to utilize different carbon sources and nitrogen sources，as well as sensitivity to osmotic pressure and different antibiotics，was examined.The fatty acid composition of C9 strain was determined by GC-MS，and the gene encoding the key enzyme for fatty acid synthesis，3-ketoacyl-ACP synthase III （FabH），was amplified and sequence homology analysis was performed.[Results]The C9 strain was classified as Streptomyces scabies based on the 16S rDNA sequence coupled with the colony morphology.However，the physiological and biochemical characteristics of the C9 strain were significantly different from those of the reported S.scabies strains.Moreover，the C9 strain showed no pathogenicity to cause potato scab by the pot tests，and the genes related to pathogenicity in PAI region were not amplified on its chromosome.All the results indicated that C9 strain was a new strain of Streptomyces scabies.The fatty acids composition of the C9 strain was analyzed further.The results showed that the strain mainly synthesized palmitoleic acid （C 16∶1） and palmitic acid （C 16∶0）.The total content of unsaturated fatty acid reached 36.2%，which also accorded with the characteristics of non-pathogenic strain of potato scab.Then the key gene of fatty acid synthesis，coding 3-ketoacyl ACP synthase III （FabH），was amplified and analyzed from the C9 strain genome.The results showed that the fabH gene sequence and the coded amino acid sequence were highly consistent with those of Streptomyces scabies.[Conclusion]The C9 strain was a new strain of Streptomyces scabies.The C9 strain provided a good material for further study on the basic metabolic mechanism of Streptomyces scab and its pathogenic mechanism.

Key wordsStreptomyces scabies;16S rDNA;Fatty acids composition

马铃薯是世界上除水稻、小麦和玉米外的第四大粮食作物，在蔬菜、饲料及工业原料领域均具有重要的经济价值[1]。但随着种植面积扩大，马铃薯相关的微生物病害逐渐凸显，其中马铃薯疮痂病（potato common scab）是一类重要的土传病害，严重影响马铃薯块茎的外观品质，造成严重的损失[2]。

马铃薯疮痂病病原菌为链霉菌属（Strptomyces spp.），国内外报道的主要有S.scabies、S.acidiscabies和S.turgidiscabies，3种菌株生理生化特征差异明显[2-5]。随着研究深入，越来越多的链霉菌病原菌被发现，表明马铃薯疮痂病菌种类多，分布和组成复杂。对我国不同地区的疮痂病原菌分析表明，在分离到的病原菌中除常见的致病菌株外，还发现S.bobili、S.galilaeus、S.enissocaesilis等新的马铃薯疮痂病菌[6]。黑龙江省不同地区马铃薯疮痂病病原菌有3种，其中S.scabies为主要病原菌，而且不同病原菌的致病力有明显差异[7]。因此我国疮痂病病原菌种类及组成具有明显的多样性，不同地区或同一地区不同季节流行不同的病原链霉菌，明确特定地区的病原菌组成对了解及防治马铃薯疮痂病十分必要，但目前未见对广东地区该病原链霉菌的研究[5]。笔者通过对土壤中分离到的链霉菌进行分析，鉴定其中的C9菌株为马铃薯疮痂病链霉菌新变种，并分析了该菌株的生理生化 特性。

1材料与方法

1.1病原菌的分离

从广东省广州周边马铃薯种植地块采集土壤，取10 g样品于90 mL无菌生理盐水中，充分振荡。静置后去上清液进行10倍系列稀释，选10-2、10-2、10-4 3个稀释度，分别取0.1 mL涂布于改良高氏1号平板，30 ℃倒置培养5 d，挑选菌落形态不同的菌株划线纯化，重复3次。

1.2致病性测定

选择健康马铃薯种薯经75%乙醇溶液浸泡10 min进行表面消毒，无菌操作切取含有芽眼的薯块，播入装有灭菌土的花盆中，每盆3块。栽种60 d后，用待测菌株孢子稀释液接种至花盆土壤，置于室温中继续培养30 d后检测新生薯块的发病情况[8]。

1.3生理生化特性测定

參照《伯杰细菌鉴定手册》[9]和《链霉菌鉴定手册》[10]中测定方法，对该菌株进行碳源利用、氮源利用、纤维素利用、淀粉利用和蛋白酶产生能力等分析，并进一步利用Biolog微孔板对多种生理生化特性及敏感性等进行测定。

1.416S rDNA序列分析与致病相关基因分析

病原菌总DNA采用细菌基因组DNA提取试剂盒（北京鼎国昌盛生物技术有限公司）的方法提取。PCR扩增用引物见表1，扩增条件：① 98 ℃预变性2 min;② 98 ℃变性20 s;③ 56 ℃退火20 s; ④ 72 ℃延伸20 s;⑤ 重复②～④35个循环。将PCR产物用1%琼脂糖电泳检测，16S rDNA扩增片段送上海生工公司测序，将得到的序列进行Blast比对，并构建系统发育树。

1.5细胞脂肪酸组成分析

在合成V号培养基中，培养马铃薯疮痂病链霉菌，离心收集菌体，按照文献[11-12]的方法，提取细菌的脂肪酸，并转化为脂肪酸甲酯（样品3个重复）。样品送华南农业大学测试中心进行脂肪酸组成GC-MS 分析。

2结果与分析

2.1C9菌株形态与16S rDNA序列分析

从马铃薯栽种土壤中采样，稀释后涂布于高氏1号培养基，培养后获得多种单菌落。其中C9菌株菌丝为丝状，革兰氏染色阳性（图1 a），培养后期生成灰色孢子，孢子链成螺旋状（图1 b）。

为确定C9菌株种属归类，利用细菌16S rDNA通用引物，以C9菌株的总DNA为模板，扩增获得约1.5 kb的16S rDNA序列（图2 a），连接T-载体后获得质粒pYYH-1，并送样测序获得16S rDNA全序列。进一步将测序结果在NCBI中GenBank数据库Blast分析，结果显示该序列与马铃薯疮痂病链霉菌同源性最高。选取与比对序列相似性大于95%的菌株和已经报道的马铃薯疮痂病链霉菌菌株16S rDNA序列，利用MEGA 7.0软件进行系统进化分析（NJ法）（图2 b）。结果显示C9菌株与马铃薯疮痂病链霉菌（Streptomyce scabiei）标准菌株ATCC49173的亲缘关系最近，相似性为 99.7%。这表明C9菌株为马铃薯疮痂病链霉菌（Streptomyce scabiei）菌株。

2.2C9菌株生理生化特性分析

进一步分析C9菌株的生理生化特征，结果显示，C9菌株能以葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、棉子糖、肌酐、肌醇等作为唯一碳源生长，但不能利用果糖、阿拉伯糖、蔗糖、甘油等为单一碳源生长。C9菌株能以脯氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸等为唯一氮源生长，但不能以组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等为唯一氮源。C9菌株对青霉素、四环素、林肯霉素、万古霉素等抗生素以及结晶紫、四唑紫、盐酸胍等化合物敏感，同时该菌株在含有10%NaCl培养基中不能生长，pH<5.5不能生长。C9菌株产生黑色素和H2S气体，不产生可溶性色素，产生淀粉酶和纤维素酶，但不产生蛋白酶。综合分析以上生理生化特性，显示C9菌株与已报道的典型马铃薯疮痂病链霉菌有明显差异，说明该菌株为新的菌株[2，13-14]。

2.3C9菌株的致病性分析

为分析C9菌株是否对马铃薯具有致病性，采用致病性盆栽试验，在马铃薯种植30 d后观察新生薯块发病情况。结果显示，C9菌株不能对盆栽马铃薯致病，未出现疮痂症状（图3）。

马铃薯疮痂病病原菌多种多样，寄主范围也较广，但致病因子均存在于染色体上的致病岛（PAI）区域。当前报道的PAI区域基因主要包括txtA基因、txtB基因、txtC基因、坏死诱导蛋白nec1基因和致病因子tomA基因等[15-17]。为研究C9菌株不能使盆栽马铃薯出现疮痂症状的原因，分别扩增了该菌株基因组上这几个致病相关的基因，但结果均未扩增到目的基因，说明C9菌株可能没有相关的致病因子或致病岛PAI，这极可能是该菌株不能引物马铃薯致病的重要 原因。

2.4C9菌株的脂肪酸组成分析

细菌采用II型脂肪酸合成机制合成脂肪酸，每步反应都由特定的酶催化完成。而脂肪酸是细菌细胞膜的重要组成物质，具有灵敏度高、成分高度保守和含量稳定等特点[18]。目前在细菌中已发现300多种脂肪酸，其碳链长度、双键位置和功能团组合的不同使其成为有效的分类标记，而脂肪酸组成和含量与微生物的遗传变异、耐药性、致病性等有极为密切的关系[19]。研究表明，链霉菌的脂肪酸组成可以作为马铃薯疮痂病链霉菌是否为致病菌的重要评价指标[20]。

为此，测定了C9菌株的脂肪酸组成。结果显示，C9菌株的脂肪酸组成较为复杂，检测到约20种不同结构的脂肪酸，包括直链饱和脂肪酸、支链饱和脂肪酸、直链不饱和脂肪酸和环丙烷脂肪酸等，检测到的脂肪酸链长包括12碳到18碳。不同脂肪酸组分含量不同，其中含量最高的棕榈油酸（C 16：1）占总脂肪酸组分的28.4%，其次是棕榈酸（C 16：0）占 18.0%。细菌的支链脂肪酸和不饱和脂肪酸在调节膜的流动性方面发挥重要作用，C9菌株产生支链脂肪酸包括12-甲基十三烷酸（isoC 14：0）、13-甲基十四烷酸（isoC 15：0）和12-甲基十四烷酸（anteisoC 15：0）等，支链脂肪酸总含量占比33.6%。不饱和脂肪酸包括棕榈油酸、顺-11-异油酸等，总含量占比36.2%（图4）。

2.5C9菌株的3-酮脂酰ACP合成酶III的同源性分 析

脂肪酸合成是细菌的基础代谢，脂肪酸合成相关的基因簇往往具有一定的保守性。3-酮脂酰ACP合成酶III（FabH）催化脂肪酸合成的起始反应，其编码基因是细菌生长的必需基因[21]。为进一步研究C9菌株的种属归类，以表1中的fabH up和fabH down引物，以C9菌株的總DNA为模板，扩增获得该菌株的fabH基因。测序结果显示，C9菌株的fabH基因与马铃薯疮痂病链霉菌（Streptomyces scabies）的fabH基因序列一致性为98.8%，其编码蛋白的氨基酸序列一致性达99.7%。这再次证明该研究分离获得的C9菌株为马铃薯疮痂病链霉菌。

3结论与讨论

该研究对从土壤中分离到的一株链霉菌C9菌株进行了分析。首先分析了该菌株的16S rDNA序列，结果显示C9菌株与马铃薯疮痂病链霉菌（Streptomyces scabiei）的16S rDNA序列高度同源，结合菌落形态特征，初步确定该菌株为马铃薯疮痂病链霉菌。

但进一步生理生化分析显示C9菌株与文献报道的马铃薯疮痂病链霉菌多种菌株都不完全一致[13-14]，提示该菌株可能是一个新菌株。采用盆栽法检测C9菌株对马铃薯的致病性，结果显示该菌株没有致病性，致病性相关的PAI基因检测结果也显示阴性，进一步说明该菌株不同于文献报道的马铃薯疮痂病的致病菌株。

由于脂肪酸组成可以作为微生物分类鉴定的重要指标，测定了C9菌株的脂肪酸组成。结果显示，与报道的链霉菌相比，该菌株的支链脂肪酸相对较低，不饱和脂肪酸含量相对较高，其特点符合Kinkel等[20]报道的马铃薯疮痂病非致病菌。该结果与盆栽致病性检测结果相吻合，也表明C9菌株为一个非致病性菌株。基于细菌脂肪酸合成途径的保守性，进一步扩展了C9菌株的脂肪酸合成关键基因——3-酮脂酰ACP合成酶III（FabH），结果显示该基因序列与马铃薯疮痂病链霉菌（Streptomyces scabiei）的fabH序列具有高度一致性，而两者编码的氨基酸序列也几乎一致，再次证明C9菌株为马铃薯疮痂病链霉菌，但该菌株没有致病性，为非致病性变种。该研究发现的C9菌株可作为研究材料，用于马铃薯疮痂病链霉菌的基础代谢研究，同时还可通过比较致病株和非致病株的基因组信息研究，探索马铃薯疮痂病链霉菌致病的分子机制。

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