辣木离体再生体系的建立

陈丽文 时群 陈乃明 何贵整 吴红英

摘要以辣木种子为外植体，诱导获得无菌苗，然后通过用无菌苗的嫩茎诱导愈伤组织分化不定芽，再将不定芽诱导生根，获得完整植株，建立辣木的离体再生体系。结果表明，适合辣木种子诱导无菌苗的培养基为 MS0，诱导率达95%;适合无菌苗茎段诱导愈伤组织的培养基为MS+2，4-D 0.8 mg/L+KT 0.2 mg/L，诱导率达87.03%;适合愈伤组织分化不定芽及不定芽增殖的培养基为改良MS+6-BA 0.6 mg/L+IAA 0.2 mg/L，芽分化率达83.33%，芽增殖系数达4.2;适合不定芽生根的培养基为 1/3MS+IBA0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L，生根率达92.7%，平均根数达5.78。

关键词辣木;离体培养;再生体系

中图分类号S 792.99文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）18-0121-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.032

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Establishment of Regeneration System in vitro for Moringa oleifera Lam

CHEN Li-wen，SHI Qun，CHEN Nai-ming et al（Qinzhou Forestry Science Research Institute，Qinzhou，Guangxi 535099）

AbstractThe seeds of Moringa oleifera were used as explants to induce and obtain aseptic seedlings， and then the callus was induced to differentiate adventitious buds by using the tender stems of seedlings，then the adventitious buds were induced to take root to obtain complete plants and establish in vitro regeneration system.Results showed that culture medium MS0 was suitable for the seeds of M. oleifera to induce sterile seedings，the induction rate was 95%.The optimal callus induced medium was MS+2，4-D 0.8 mg/L+KT 0.2 mg/L，the induction rate was 87.03%.The optimal medium for adventitious buds differentiation and multiplication were modified MS+6-BA0.6 mg/L+IAA0.2 mg/L，the differentiation rate was 83.33%，the muitiplication coefficient was 4.2.The optimal rooting culture medium was 1/3MS+IBA0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L，the rooting rate was 92.7%，the average root number was 5.78.

Key wordsMoringa oleifera;in vitro culture;Regeneration system

辣木（Moringa oleifera Lam.）為辣木科辣木属植物，又称鼓槌树，是一种有独特经济价值的热带植物，原产于印度北部[1]。辣木是目前已发现的最好植物蛋白、维生素A、叶酸、泛酸、钙、铁、硒等多种营养素的来源，其叶、果均有优良的食用和药用价值，果实提取的植物油具有独特的工业用途，是全球最热门的高营养多用途植物，在很多国家都作为重要药食和工业原料来利用，被誉为“植物中的钻石”[2-5]。

目前，辣木主要的育苗方式是播种繁殖和扦插，不仅育苗周期长、繁殖系数低，会造成品种退化，而且易受季节气候条件的限制[6]。通过离体快繁建立植株再生体系是解决辣木种苗繁殖的一种有效途径，为辣木良种苗木的规模化生产提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料选用辣木改良种PKM1的种子作为外植体材料，种子采自云南。

1.2方法

1.2.1无菌苗诱导。

选取颗粒饱满的良种辣木种子，剥去外种壳，将种仁在超净工作台上以0.1%HgCl2溶液消毒 10 min，再用无菌水冲洗5遍，沥干水后接种到初始诱导培养基上，放置在培养室用黑布遮盖进行暗培养，待种子开始萌动，长出白色根，再掀开黑布继续培养直至长成无菌小苗。

1.2.2愈伤组织诱导。

将获得的无菌苗剪切成约1 cm小段，接种到愈伤组织诱导培养基上，每瓶培养基接入3个小段，每种培养基接种15瓶，接种时使切口与培养基相接触，接种后放置在培养室用黑布遮盖进行暗培养15 d，待愈伤组织形成后移到自然光条件下培养，30 d后统计愈伤组织的诱导率。

1.2.3不定芽诱导与增殖。

将长出的愈伤组织切下接种至不定芽诱导培养基上培养，每瓶培养基接种2个愈伤组织块，每种培养基接种15瓶，接种后放在培养室用黑布遮盖进行暗培养10 d，待不定芽萌出后移到自然光条件下培养，30 d后统计不定芽的诱导率，然后每隔30 d将不定芽转接到适宜的培养基上进行增殖培养。

1.2.4生根诱导。

剪取生长健壮的不定芽接种至生根诱导培养基上，每瓶培养基接种10株小芽，每种培养基接种15瓶，接种后放在培养室内弱光条件下培养，待小苗的基部切口处长出根系后移到炼苗棚进行炼苗，炼苗15 d左右就可以进行生根苗的移栽。

1.2.5培养基及培养条件。

1.2.5.1培养基。基本培养基为MS培养基，根据不同培养阶段的需要添加不同浓度的生长调节剂、防褐化剂、其他添加物等。培养基pH为5.8，诱导、增殖培养基每升添加3.8 g琼脂粉、30 g白砂糖，生根培养基每升添加4.2 g琼脂粉、20 g白砂糖。培养基在121 ℃高压灭菌锅灭菌20 min。培养基取出后自然冷却，待其凝固后即可使用。

1.2.5.2培养条件。

培养室温度保持在（25±2）℃，空气湿度为75%～85%，光照强度为2 000～3 000 lx，每天光照时间为12 h。

1.2.6数据处理。采用DPS数据处理系统对数据进行方差分析和LSD多重比较。

2结果与分析

2.1无菌苗诱导情况

通过辣木种子诱导获取无菌苗比较容易，将经过消毒处理的辣木种仁接种到初始诱导培养基MS0（不加任何激素和添加物）中，暗培养7 d后种子开始萌动，长出长约1 cm的白色根，然后掀开黑布继续培养3～5 d即可长出小苗，15～20 d无菌苗可长至3～4 cm，无菌苗的诱导率达95%。

2.2不同生长调节剂组合对辣木无菌苗茎段诱导愈伤组织的影响

将辣木无菌苗剪切成小段，接种到愈伤组织诱导培养基上培养10 d左右，茎段两端慢慢翘起，茎段弯曲，茎段两端切口部位开始出现少量愈伤组织，大约20 d，大部分茎段切口处形成愈伤组织，愈伤组织诱导情况见表1。

从表1可以看出，A4处理的无菌苗茎段愈伤组织的诱导率最高。统计分析表明，A4处理与其他处理均存在显著差异。根据观察结果可知，随着2，4-D浓度的增加，愈伤组织的诱导率也增高，但浓度过高容易导致愈伤组织表面出现老化现象。综合比较看出，A4培养基的诱导率最高，愈伤组织生长也较好，愈伤组织质地致密，黄绿色。MS+2，4-D0.8 mg/L+ KT0.3 mg/L为适合愈伤组织诱导的培养基，诱导率达 87.03%，诱导出的愈伤组织生长状况最好。

2.3不同无机盐浓度及生长调节剂组合对辣木不定芽分化及增殖的影响

将无菌苗茎段切口长出的愈伤组织切下接种到芽分化培养基上培养，25 d左右愈伤组织块上分化出不定芽，待芽高长到约3 cm时，将芽丛切下，接种至同样的培养基上进行增殖培养。辣木不定芽分化及增殖情况见表2，对试验结果进行统计分析，结果见表3、4。

从表3可以看出，不同无机盐浓度的基本培养基对辣木不定芽分化及增殖的影响存在显著差异，其中改良MS培养基的平均芽分化率和平均芽增殖系数更高，分别为63.33%和3.18;而且，以MS为基本培养基诱导分化的不定芽长出的叶片颜色偏黄，有掉叶的现象，而采用经过改良的MS作为基本培养基诱导的不定芽则比较健壮，长出的叶片颜色翠绿，这可能是由于改良MS培养基中适当提高了KH2PO4和铁盐的浓度，在培养基中提高磷酸根离子水平可抵消IAA对芽分化的抑制作用，增加芽的增殖率[7];而铁盐是培养基中用量较多的一种无机盐类物质，对植物组织叶绿素的合成和延长生长起到重要的作用[8]。

从表4可以看出，同样浓度的6-BA分别与NAA、IAA组合的培养基对辣木愈伤组织分化芽及芽的增殖效果不同，两者之间存在极显著差异，添加IAA的培养基愈伤组织诱导芽的分化率、增殖系数更高，芽生长也较好;此外，试验发现，在同样浓度的生长素组合下，随着6-BA浓度的提高，不定芽会出现玻璃化、叶片卷曲的现象，因此，6-BA0.6 mg/L+IAA0.2 mg/L為更好的生长调节剂浓度组合配比。

经综合比较，改良MS+6-BA0.6 mg/L+IAA0.2 mg/L培养基比较适合辣木不定芽的分化和增殖，芽分化率达 83.33%、芽增殖系数达4.2，且芽生长健壮，叶片舒展、叶色 翠绿。

2.4不同无机盐浓度及生长调节剂组合对辣木不定芽生根的影响

剪取生长健壮、长约3 cm的不定芽接种至生根诱导培养基上，放在培养室内弱光条件下培养，15 d后小苗的基部切口处开始长根。辣木不定芽生根情况见表5，对试验结果进行统计分析，结果见表6、7。

从表6可以看出，不同无机盐浓度的基本培养基对辣木不定芽生根的影响存在显著差异，不同无机盐浓度的基本培养基的生根效果为1/3MS>1/2MS>MS，可以看出辣木不定芽生根诱导需要较低的无机盐浓度，以无机盐浓度为1/3MS时的平均生根率和平均根数最高，分别为81.13%和4.36。所以，辣木不定芽生根选用1/3MS为基本培养基比较合适。

从表7可以看出，添加不同生长调节剂IBA、NAA及两者组合的生根培养基对辣木不定芽生根的效果不同，其中以IBA和NAA组合的生根效果好，并与单独添加IBA或NAA的生根效果存在极显著差异。单独添加同浓度的IBA或NAA的生根培养基的辣木不定芽生根率和平均根数差异不显著，但从表5看，单独添加IBA的生根培养基培养的小苗根系较细长、侧根较少，单独添加NAA的生根培养基培养的小苗根系较粗短、侧根较多，而添加IBA与NAA组合的生根培养基培养的小苗根系粗壮、须根发达。因此，IBA 0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L为适宜辣木不定芽生根的生长调节剂组合。

经综合比较，1/3MS+IBA0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L培养基比较适合辣木不定芽生根，生根率达92.7%，平均根数达 5.78，且根系粗壮、须根发达。

3讨论

（1）外植体材料的选择常常是组织培养获得成功与否的关键。从理论上讲，植物的任何组织或器官都能作为组织培养的外植体，但由于植物种类、生长阶段、生理状态、年龄、生长部位等不同，其无性繁殖能力也不一样，同一植物不同的组织和器官其再生能力也有差异[9]。该试验采用辣木种子作为外植体，诱导获得无菌苗，再用无菌苗的茎段诱导愈伤组织，通过愈伤组织分化不定芽，最终形成完整植株。通过种子虽然能较快地获得无菌材料，但须经过愈伤组织的途径才分化获得不定芽，过程相对较长。今后可尝试以辣木苗嫩枝作为外植体，直接诱导获得无菌芽进行繁殖，为辣木离体再生体系的建立提供更多的途径。

（2）辣木对细胞分裂素特别敏感，在离体培养过程中极易产生玻璃化现象。玻璃化是在芽分化启动后的生长过程，

由碳水化合物、氮代谢和水分状态等发生生理性异常所引起，它受多种因素影响和控制，主要有温度、光照、激素种类和浓度、琼脂用量、酸碱度、糖浓度、碳氮比、乙烯等[10]。该试验通过调节光照、激素浓度可以大大减少玻璃化苗的产生。

（3）在辣木离体培养过程中，无论是增殖培养还是生根培养，均很容易出现叶子黄化脱落的现象。该试验通过提高铁盐的浓度，并调节琼脂和蔗糖的用量可减少叶子黄化 脱落。

（4）在辣木不定芽生根培养时，将培养基中无机盐浓度降低，可提高生根率，这种无机盐浓度降低的功能虽不是十分明确，但培养基中的盐浓度会影响到其渗透压，从而影响到植物离体培养物的营养吸收和向培养基中释放一些物质，促进植物生根。

参考文献

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[9]宋维秀.柴松组织培养技术研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2009.

[10]蔡祖国，徐小彪，周会萍.植物组织培养中的玻璃化现象及其预防[J].生物技术通讯，2005，16（3）：353-355.