猪博卡病毒及其感染的研究进展

赵爱娟 丁义峰 刘 萍

（河南师范大学生命科学学院 河南新乡 453007）

1 猪博卡病毒的发现

2005年，Allander 等［1］借助分子筛的方法从儿童呼吸道感染的样品中发现了一种新的微小病毒，该病毒可以感染人类，故称之为人博卡病毒（Human Bocavirus，HBoV）。2009年，Blomstrom 等通过随机多重置换方法（random multiple displacement amplification，MDA）在瑞典猪（患多系统衰竭综合征）样品中分离出一段病毒基因组序列，该序列长为1879bp。通过序列分析并与已知病毒基因组序列相比较，发现该序列有完整的NP1氨基酸序列，且与牛细小病毒（Bovine parvovirus，BPV）同源性最高，同时与HBoV、犬微小病毒（Canine minute virus，CnMV）和BPV 处于同一进化簇，但与猪细小病毒（Porcine parvovirus ，PPV）无亲缘关系。由于对该微小病毒研究尚不彻底，没有完整的基因组序列，故当时将其暂命名为猪博卡病毒（Porcine Boca-like virus，PBoV-like）［2］。2011年，国内很多猪场的猪连续出现腹泻性疾病，研究人员从腹泻仔猪的粪便中分离出了猪博卡病毒［3］。

2 猪博卡病毒的生物学性状

猪博卡病毒为博卡病毒属，微小病毒科，细小病毒亚科。猪博卡病毒体积小，无囊膜，呈正二十面体。其基因组为单链线性DNA，为DNA 病毒。研究人员对其DNA 测序发现，DNA 链短且结构简单，仅有5.2kb［4］。猪博卡病毒与其他细小病毒科的成员不同，除具有与其他成员相同的2个开放阅读框ORF1和ORF2外，还有一个开放阅读框ORF3。病毒的DNA 能转录翻译4种蛋白质，分别为NS1、VP1、VP2和NP1（图1）。其中VP1、VP2为结构蛋白，是主要的抗原蛋白，NS1、NP1为非结构蛋白［5］。研究发现，博卡病毒的非结构蛋白较为保守，而结构蛋白VP1、VP2较易发生突变，不稳定结构的基因突变可能会导致新种群的产生，也有可能是病毒逃逸机体免疫系统监视的重要机制，稳定的NS1基因可能成为制备疫苗和药物作用的靶位点［6］。谭绍敏分析了28条猪博卡病毒的基因组序列，发现猪博卡病毒普遍存在基因插入现象，而且变异率较高，具有遗传多样性［7］。生物信息学分析发现在病毒的ORF1中，有与病毒滚环复制、解螺旋酶 （Helicase） 和三磷酸腺苷酶（ATPase） 活性相关的保守序列。在病毒的ORF2中，VP1基因编码序列内有与病毒感染性相关的磷脂酸A2序列存在，且与钙离子结合环及催化残基相关序列连在一起［8］。而ORF3（编码NP1蛋白）功能尚不明确，但有报道显示与猪博卡病毒同属的犬极细小病毒或犬博卡病毒的ORF3与病毒的复制密切相关［9］。

图1 PBoV 的基因结构模式

3 猪博卡病毒的致病机制

Abdel 等［10］研究发现猪博卡病毒侵染靶细胞后，靶细胞膜破裂，细胞内容物释放到外环境中，呈坏死性变化，而不是发生细胞凋亡。现已普遍认为结构蛋白NS1在病毒复制过程中发挥重要作用，是细小病毒的多功能磷酸化蛋白。李建宁等［11］用敲除NS1基因的载体感染靶细胞，病毒基因组丧失感染力和致病性。而敲除NP1基因后，病毒的DNA 复制能力也大幅度下降。用病毒的NS1、VP1、VP2、NP1基因分别侵染靶细胞，靶细胞没有明显的病变特征。武刚利用猪博卡病毒细胞培养物感染3日龄的仔猪，发现被感染仔猪出现腹泻现象。对仔猪进行剖检，发现被感染仔猪腹股沟淋巴结和结肠肿大，肠道、肺脏、腹股淋巴结均有不同程度的出血，最终检测到被感染猪的肠道内有猪博卡病毒［12］。Zhang 等利用人博卡病毒（HBoV）克隆载体感染细胞，发现HBoV 能明显抑制IFN-β 的产生，IFN-β 是由仙台病毒和多聚脱氧腺－胸苷酸［poly（deoxyadenylic-thymidylic）acid］诱导产生的，同时证实病毒非结构蛋白NP1在该过程中发挥了重要作用［13］。

4 猪博卡病毒的国内流行情况

2009年，Zhai 等［14］首次证明了我国猪群中存在猪博卡病毒感染，在患呼吸道疾病的断奶仔猪中的感染率（69.7%，69/99）明显高于在其他猪群中的感染率（0～13.6%）。对来自浙江、江西、安徽、河北、河南、江苏、北京、上海、新疆9省市的送检病料，PBoV 的检出率在12.5%～88.9%，并且在健康的猪样品中也检测到PBoV 的存在，检出率为7.3%（3/41）。2010年，Shan 等［15］从340份猪病料中检测到PBoV，这340份猪病料分别来自上海、安徽、江苏、山东及贵州，其阳性率高达45%～75%。2010年Cheng 等［16］检测397份病料，检测出PBoV 阳性率为12.9%。2011年，中国香港学者Lau SK 等［8］从香港生猪屠宰场和养猪场的健康猪和病死猪中采集333份健康猪和病死猪的淋巴结、血清和粪便等样品，通过PCR 方法检出55份PBoV 阳性样品，阳性率为16.5%。胡军勇等［17］对河南、湖北、湖南的各大猪场进行了调查研究，从79个规模化猪场采集了248份病料样品，这些样品中有172份为PBoV 阳性，阳性率高达69.35%。这些研究结果表明，猪博卡病毒在我国猪群中广泛存在，可能会导致一些呼吸道疾病的发生。

5 猪博卡病毒的检测方法

目前，对猪博卡病的检测方法主要有聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、荧光定量PCR 法、环介导等温扩增技术、间接免疫荧光技术。

1）PCR：翟少伦等［18］参照GenBank 发表的猪博卡病毒的唯一序列，利用引物设计软件Primer 5.0，设计一对在编码VP1/VP2蛋白的基因区特异性的引物。扩增大小为496bp 目的基因。在国内首次建立了猪博卡病毒的检测方法，其优点是：特异性强，重复性较好，敏感性高。

2）荧光定量PCR 检测方法：邓波等［19］根据GenBank 公布的猪博卡病毒序列，在VPl/2基因区域设计引物和TaqMan 探针建立实时荧光定量PCR 检测方法，利用该方法对上海市10个区规模场2006—2011年间采集的1800份猪血清、2010年种猪场不同月份采集的45份猪粪便、2010年9个规模场采集的27份猪鼻棉拭，以及门诊采集的9份高热病死猪内脏进行检测，阳性率依次为24%、30%、0%、67%。

3）环介导等温扩增（LAMP）技术：李彬等［20］建立了PBoV 的LAMP（loop-mediated isothermal amplification）检测方法。该技术分别使用特异对应于靶序列中8个基因区段的3对特异性引物，并在Bst DNA 聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增反应，整个反应只需在65℃的恒温水浴中1～2h。该方法的步骤为，设计LAMP 引物，优化LAMP 反应体系，LAMP 检测程序。研究人员根据检测的原理和方法设计一套检测试剂盒，该试剂盒虽不需要先进的设备，但具有特异性强，敏感性高，操作简便等优点，因此易于推广使用。

4）间接免疫荧光技术：Mckillen 等［21］建立了PBoV 原代细胞培养系统的同时，构建了间接免疫荧光方法，主要的操作为：首先将待测细胞用未标记的抗体处理，使之与特异性的抗原形成复合物，然后再用荧光标记使抗体着色，可检测出特异抗原在细胞中的存在部位，并且有荧光增强效应。Mckillen 等在猪原代肾细胞的细胞核发现了绿色荧光集结，细胞质周围颜色较暗。

6 疾病的症状及猪博卡病毒的防控方法

1）疾病的症状：猪博卡病毒可感染动物的呼吸道及肠道，使动物出现支气管炎、肺炎和急性与慢性肠炎等症状，甚至会引发动物流产、死胎及死亡。感染博卡病毒的产房哺乳仔猪多在出生2～3日后，出现严重的腹泻，粪便呈黄绿色、淡黄绿色或灰白色，部分仔猪有呕吐症状，致使仔猪消瘦，精神沉郁，被毛粗乱，少吃或不吃，一般在5～7日内死亡，10日龄内的乳猪死亡率高达80%，随日龄的增加，死亡率逐渐降低。

2）防控方法：做好消毒工作，使用碘制剂类和烧碱加强消毒，对喂养的饲料进行消毒处理。母猪产床前后消毒，产仔舍消毒，饲养员消毒；提高猪群营养补充，增强猪的免疫力，注重其他疾病的防控，例如定期接种猪呼吸与繁殖障碍综合征疫苗、猪瘟疫苗、猪圆环疫苗和伪狂犬疫苗等疾病疫苗，以防止出现混合感染加重病情； 加强饲养管理，及时隔离患病猪群，合理处理死亡猪群，坚持不从疫病区引种，确保饲喂的饲料没有发霉变质，以增强猪的非特异性免疫；做好干燥通风工作，在猪舍栏杆及潮湿处洒生石灰，进行干燥消毒，猪需定期通风；母猪反饲，对母猪进行反饲，以预防疾病发生，用仔猪粪便对产前6周母猪进行返饲，方法是采集病猪的肠内容物或仔猪的粪便研磨稀释处理后加入饲料中，饲养母猪。

7 小结

猪博卡病毒是研究人员在猪群中新发现的病原体。随着研究的深入，在猪博卡病毒的流行病学及病原学方面取得了一定的进展。但是，目前该病毒的临床致病机制及是否与其他病原体协同致病尚不清楚，仍需进一步研究。由于人类和猪关系密切，猪博卡病毒的基因和人博卡病毒的基因可能会发生重组，甚至可能感染人类。因此，对猪博卡病毒的深入研究在公共卫生学方面具有重要意义。