红裙步甲化学防御研究

郭明磊 柏超 曹杰 刘鹏 韩文鑫 宫立胜 董艳

摘要    本文以红裙步甲作为试验昆虫，初步探究昆虫的化学防御行为。通过解剖发现，红裙步甲的防御腺由分泌腺、贮液囊、反应室和输出管组成，而且雌雄虫存在着差异。用二氯甲烷作为萃取剂，采用气相色谱-质谱（GC-MS）分析其化学防御物质成分，获得21个峰，检测出18种化学成分，结果发现，红裙步甲防御物质主要成分是甲基丙烯酸和2-甲基-2-丁烯酸。

关键词    红裙步甲;化学防御;防御腺;防御物质

中图分类号    Q964         文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2019）17-0117-03                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Abstract    In this paper，Carabus augustus were used as experimental insects to explore the chemical defense behavior of insects.Through anatomy，it was found that the defensive gland of the Carabus augustus was composed of the secretory gland，the reservoir，the reaction chamber and the output tube，and there were differences between the male and female.Using dichloromethane as the extractant，the chemical defense component was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS），21 peaks were obtained，and 18 chemical components were detected.The main components of the defensive substance were methacrylic acid and 2 -methyl-2-butenoic acid.

Key words    Carabus augustus;chemical defense;defensive gland，defensive substance

昆虫是所有生物中种类及数量最多的一群，是动物界中发展最繁盛的一个类群，目前已命名逾100 萬种，其分布几乎遍布全球。为了适应各种不同的生活环境，一些种类成功地进化出较为完善的防御机制。根据其不同的防御机制，大致可分为隐匿防御、假死和恐吓防御、机械防御、化学防御以及集群和社会性防御。昆虫的化学防御是用其自身的特殊结构分泌并释放化学物质以保护自己，是众多防御类型中最为复杂、效果最佳的一种[1]。

国内对昆虫化学防御物质的研究起步较晚，而且多集中在拟步甲科昆虫的防御结构研究方面，对步甲科昆虫研究较少。梁永生[2]报道了赤拟谷盗成虫和幼虫化学防御物质的主要成分以及其成分对成虫、幼虫的作用，主要成分是甲醌、1-十五碳烯、1，6-十七碳二烯、芍药醇，这些成分能够引诱幼虫但是对成虫具有排斥作用。刘 勇等[3]分析了云南琵琶甲（喙尾琵琶甲）防御物质的抗菌活性及化学成分，主要成分是1，4-苯醌，对细菌普遍具有抑制作用。任国栋等[4]通过研究34种琵甲属昆虫防御腺的结构，探讨了其进化关系;并于2002年根据琵甲族11属58种防御腺的结构特征，探讨了属间的进化关系[5];2009年基于18个代表种的防御腺特征，探讨了中国刺甲族的属级关系[6]。叶 晔等[7]对141族31属 50种拟步甲科昆虫的防御腺结构特征和系统发育关系进行了研究。强承魁等[8]研究了黄粉虫防御物质的化学成分和其抑菌活性。罗建蓉等[9]研究了喙尾琵琶甲的化学成分。施贵荣等[10-12]研究了体外防御物质的化学成分及其抗菌活性。郭明磊等[13]用气相色谱-质谱分析了喙尾琵琶甲化学防御物质的化学成分，并研究了化学防御物质的抑菌活性。季莉丽[14]研究表明，广炮步甲的防御腺化学物质有6种，主要成分为甲基对苯二酚、对苯二酚、甲基对苯醌与对苯醌。

步甲的防御腺一般着生于腹部末端。日本科学家Kats-uo等[15]研究部分步甲科昆虫的防御腺结构，并将其分为三大类六小类（图1）。图中A、B、C类型的防御腺主要分泌的防御物质是脂肪酸类物质，D类型主要分泌甲酚类物质，E、F类型主要分泌苯醌类物质。Will等[16]报道了Catapiesis bart-yrae和Catapiesis mexicana在电镜下防御腺的细胞结构。

步甲科昆虫的化学防御分泌物的化学成分种类复杂，有短链有机酸、酮、醛、芳香族化合物以及某些特有的化合物。多种步甲的分泌物是甲酸，Dicaelus属步甲的化学防御物质含有75%的甲酸。曾有人报道过一种步甲Brachinus的臀腺能合成氢酮和过氧化氢等化合物[17]。臭广肩步甲Calos-oma sycophanta的防御物质主要成分是甲基丙烯酸和水杨醛，Carabus ullrichii的防御物质主要成分是甲基丙烯酸和当归酸，Abax parallelepipedus的防御物质是甲基丙烯酸和巴豆酸;甲基丙烯酸、巴豆酸和异丁酸在以上3种步甲中存在[18]。边园步甲Omophrom limbatum、大头肉步甲Broscus cephalotes 的防御物质是2-甲基丙酸和3-甲基丁酸;气步甲属 Brach-inus crepilaus化学防御物质的主要成分是苯醌、甲基苯醌等。Metrius contractus化学防御物质的主要成分是1，4-苯醌、十五烷、（6Z，7Z）-6，9-Heptadecadiene和（7Z，9Z）-7，9-Heptadecadiene[19]。青步甲属昆虫Chlaenius cordicollis化学防御物质的主要成分是2，5-二甲基苯酚和3-乙基苯酚[20]。粒步甲Carabus granulatus、Carabus intricatus、Carabus auronit-ens、Carabus auratus和Carabus irregularis等步甲属昆虫化学防御物质的主要化学成分是甲基丙烯酸和巴豆酸（又称反式丁烯酸、 β-甲基丙烯酸）[21-25]。

红裙步甲（Carabus augustus）属于鞘翅目（Coleoptera）肉食亚目（Adephaga）步甲总科（Caraboidea）步甲属（Carabus），是一种重要的捕食性天敌昆虫资源，同时也是一种观赏性昆虫，主要分布在我国江西一带，喜食鳞翅目幼虫、蛹，还可以捕食金龟幼虫、蝼蛄、叩甲卵和幼虫、蚜虫等害虫。目前国内还没有相关文献的报道，通过本研究了解红裙步甲防御结构和分泌物成分，以期为昆虫化学防御机制的研究及其进一步开发利用提供理论基础依据。

1    材料与方法

1.1    供试昆虫与仪器

供试昆虫为红裙步甲，采自江西省新余大岗山自然保护区。供试仪器为体视显微镜（Carl Zeiss SteREO Discovery.V20，德国卡尔蔡司集团生产）、剖镜（Leica S6E，德国莱卡）、气相色谱-质谱联用仪（HP6890GC/5973MS，美国Agilent Techno-logies公司生产）。

1.2    试验方法

1.2.1    防御腺解剖。参考刘春林[26]的方法，将红裙步甲的干制标本放于10%氢氧化钠溶液中煮10 min左右，取出后用清水冲洗干净，然后用解剖镜剥离与防御腺无关的组织获得防御腺结构。用蒸馏水将其清洗干净，移入1%伊红溶液中染色。

1.2.2    防御物质GC-MS分析。

（1）化学防御物质收集。将红裙步甲腹部后端放在1.5 mL EP管口，经物理刺激，收集由臀腺喷射出的防御物质。每管每次收集原液约为200 μL，向其中加入100 μL 二氯甲烷萃取，重复3次。经10 000 r/min高速离心10 min。离心后分泌物分为上层水溶性和下层水不溶性2部分，将其水溶性部分吸出，然后将其下层不溶于水的部分置于-20 ℃下玻璃管中保存。同样方法收集疤步甲Carabus pustulifer和喙尾琵琶甲Blaps rynchopetera的化学防御分泌物。

（2）GC-MS分析。GC条件：HP-5MS石英毛细管柱（30 mm×0.25 mm×0.25 mm）;柱温为起始温度40 ℃，程序升温3 ℃/min至80 ℃，再程序升温5 ℃/min至260 ℃;柱流量为1.0 mL/min;进样口温度250 ℃;柱前压100 kPa;进样量1.0 mL;分流比10∶1;载气为高纯氦气。MS条件：电离方式EI;电子能量70;传输线温度250 ℃;离子源温度230 ℃;四极杆温度150 ℃;质量范围35～500;采用wiley7n.l标准谱库检索定性。

2    结果与分析

2.1    防御腺

通过解剖，观察红裙步甲防御腺的结构，如图2所示。防御结构着生于腹部最后一节，由分泌腺、贮液囊、反应室和输出管组成，分泌腺着生在贮液囊上，防御液可以储存在贮液囊中，当遇到天敌或者病原菌时，由输出管喷射而出。雌虫具有4个贮液囊，反应室上、下、左、右各有1个，其中上、下2个贮液囊较大，左、右较小;雄虫仅有左、右2个贮液囊。雌虫位于反应室左、右方向的贮液囊狭长且端部膨大，由一输出管与反应室连接;位于反应室上、下方向的贮液囊宽大，直接与反应室相连。囊壁上具有花纹和褶皱。

2.2    防御物质GC-MC分析

按照试验方法，测出红裙步甲的分泌物总离子图（图3），得到21个峰;各峰经过GC-MS分析得到质谱图，经质谱库鉴定，共鉴定出18种成分，如表1所示。结果表明，所鉴定的18种化学成分占总含量的99.18%。甲基丙烯酸、2-甲基-2-丁烯酸、十八碳烯酰胺以及二十二碳烯酰胺相对含量分别是55.22%、30.40%、3.69%、3.67%，占总含量的92.98%，其中前二者占总含量的85.62%。因此，甲基丙烯酸和2-甲基-2-丁烯酸为主要成分。

另外，将检测到的各种成分按照类别可以分为烯酸类（包括甲基丙烯酸和2-甲基-2-丁烯酸），占85.62%;胺类（包括十八碳烯酰胺、二十碳烯酰胺、二十二碳烯酰胺、十四酰胺、十六酰胺和十八酰胺），占12.52%;酸类（包括2-甲基丁酸、苯甲酸和十六烷酸），占0.54%;烷类（包括2，6，10，14-四甲基十五烷、十九烷、二十三烷和二十五烷），占0.28%;烯类（包括二十三碳烯和角鲨烯），占0.15%;醛类（仅有壬醛），占0.07%。因此，烯酸类是红裙步甲化学防御物质的主要成分。

3    结论与讨论

3.1    防御腺结构

红裙步甲雌、雄虫的防御腺结构不同，雌虫有贮液囊4 个且贮液囊大，雄虫仅有2个且贮液囊小。原因可能有2个方面：一是雌虫有繁殖后代的任务，需要消耗的能量多、捕食多，同时要防御天敌，因而需要较多的防御液以满足对食物和能量的需求;二是雄虫的外生殖器较大，占据了较大的空间，阻碍了防御结构的生长。另外，红裙步甲囊壁上具有花纹和褶皱，不仅使得贮液囊的表面积和容积变大，能够贮存更多的防御液，同时增强了贮液囊的弹性和韧性。

红裙步甲的防御物质主要成分是甲基丙烯酸和2-甲基2-丁烯酸，而Katsuo and Masanori划分的6个类型分泌的主要物质是脂肪酸、甲酚和苯醌类物质，分泌物不同防御腺结构存在着差异。说明红裙步甲的防御腺结构并未在其划分的類型中。

3.2    防御物质化学成分

学者Le■i■等[18]研究发现，步甲属Carabus ullrichii的防御物质化学成分包含7种，分别是甲基丙烯酸（78.7%）、水杨醛（17.7%）、α-甲基巴豆酸（2.5%）、苯甲酸（0.4%）、异丁酸（0.3%）、丁酸（0.2%）和2-甲基丁酸（0.2%）。在本研究中，红裙步甲化学防御物质的主要成分是甲基丙烯酸和2-甲基-2-丁烯酸，这一结果与上述结果既有相同的地方，也有不同之处。相同成分为甲基丙烯酸（55.22%）、2-甲基丁酸（0.13%）和苯甲酸（0.11%），其中甲基丙烯酸均是主要成分;类似成分为2-甲基-2-丁烯酸（30.40%），与α-甲基巴豆酸是同分异构体;其余成分是两者不同之处，如本研究中含有十六酰胺（3.23%）、十八碳烯酰胺（3.69%）、二十二碳烯酰胺（3.67%）以及一些长链烷类、烯类等化学成分是Le■i■等学者的研究结果中没有的，而水杨醛、异丁酸以及丁酸在本研究中没有发现。

3.3    展望

昆虫化学防御物质具有杀灭细菌的作用，如丽蝇蛹集金小蜂的防御素Navidefensin2-2能够抑制一批革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，可作为抗感染药物资源[27]。许多蜂类的毒液已经进入商品开发阶段，对许多人类疾病有治疗作用。在农业部提出“双减”目标的前提下，可合理利用植物、昆虫自身的化学防御物质来抑制细菌、真菌、昆虫，以达到减少化学农药使用的目的[28]。现已知的昆虫体外物质的研究非常少，分离、提纯各种防御物质可为生化、药理研究及治疗人类疾病提供借鉴，因而此方面的研究前景广阔。

4    参考文献

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