基于代谢组学分析不同颜色花生红衣的组成差异

贾 聪，芦 鑫，高锦鸿,2，孙 强,2，朱笑鹏，王 强，黄纪念,4,*

（1.河南省农业科学院农副产品加工研究所，河南 郑州 450002；2.河南省农产品生物活性物质工程技术研究中心，河南 郑州 450002；3.中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193；4.农业农村部油料加工重点实验室，湖北 武汉 430062）

花生是具有很高营养价值的豆科植物[1]，种植面积仅次于油菜，居世界油料作物第二位[2]。我国生产的花生45%～50%被用于榨油，其他用以制作花生食品（花生酱、花生饮料、油炸花生仁等）。花生红衣是花生加工生产后的副产物，但其常作为废弃物直接被丢弃或用作动物饲料，资源未得到充分利用[3]。

中医认为花生红衣味甘、微苦、性平，主治止血、散淤、消肿，具有极大的药用价值[4]。现代医学研究表明，花生红衣中原花青素可以降低小肠吸收胆固醇，缓解动脉粥样硬化[5-6]。利用花生红衣萃取液精制而成的注射液应用于血友病、血小板减少症紫癜、肝脏出血、术后出血后，80%以上病例具有令人满意的止血效果[7-8]。花生红衣由于其可食用性，还可作为功能因子用于糖和饮料中[9-10]。因此，花生红衣具有广阔的应用前景。

然而对花生红衣的研究起步较晚，已有研究表明花生红衣中含有丰富的多酚类化合物，如白藜芦醇、原花青素、黄酮类色素等物质[11]。白藜芦醇是一种非黄酮类多酚化合物，花生红衣中的含量约为0.65 mg/g[12]，具有抗炎、抗过敏、保肝利肝等生理功能[13]。原花青素属于黄酮醇类化合物，花生红衣中的原花青素抗氧化活性较强[14]，较白藜芦醇和抗坏血酸具有更强的清除自由基的能力[15]。黄酮类色素是以黄酮为母核而衍生的一类黄色色素，具有抗肿瘤、保护心血管系统、延缓衰老等作用[16]。我国的花生种类繁多，不同品种的花生在外观、组分及性质上有明显差异[17]，其花生红衣的组成也存在差异，目前已有的研究并未系统深入讨论花生红衣代谢层面的差异。代谢组学主要对生物体内代谢小分子和代谢网络的动态调控进行全局性分析[18]，作为一种新兴的研究手段，该技术已成功应用于营养学、毒理学、疾病诊断等各个领域[19-20]。采用代谢组学可快速全面分析花生红衣中多种具有生物活性代谢物的含量变化，有利于科学评估花生红衣的应用价值，为花生红衣的质量控制及花生种源选育提供参考。

因此，本实验选取3 种具有明显颜色差异的花生红衣作为研究对象，采用非靶向代谢组学分析不同花生红衣品种间的差异代谢物，并对差异代谢通路进行富集，以揭示不同颜色花生红衣代谢差异性，以期为花生红衣的加工应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花生品种（图1）分别为‘冀花4号’（L*＝44.30、a*＝20.62、b*＝2.46）、‘四粒红’（L*＝31.70、a*＝22.48、b*＝15.26）、‘国育2016’（L*＝20.19、a*＝7.93、b*＝2.46），由河南绿色作物研究中心提供；花生经去红衣机分离并收集红衣。

甲醇、甲酸、水、乙腈（色谱级） 德国CNW公司；L-2-氯苯丙氨酸（分析纯） 上海恒创生物科技有限公司。

图1 花生品种外观Fig. 1 Photographs of peanut cultivars with varying skin colors

1.2 仪器与设备

JXFSTPRP-24/32全自动样品快速研磨仪 上海净信实业发展有限公司；TYXH-I漩涡振荡器 上海汗诺仪器有限公司；TGL-16MS台式高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；SB-5200DT超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；Acquity UPLC超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）仪、Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） 美国沃特世科技有限公司；Triple TOF 5600高分辨质谱 美国应用生物系统公司。

1.3 方法

1.3.1 花生红衣的前处理

称取80 mg花生红衣，加入内标（用甲醇分别配制0.3 mg/mL L-2-氯苯丙氨酸和0.01 mg/mL十七烷烃）各20 μL和1 mL提取剂（体积分数80%甲醇溶液，含0.01 mol/L 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、体积分数0.1%甲酸溶液）；在-20 ℃放置2 min预冷，加入研磨机60 Hz处理2 min；超声提取30 min（4 ℃）；-20 ℃静置20 min；离心15 min（13 000 r/min、4 ℃），用注射器吸取200 μL上清液，使用0.22 μm的有机相针孔过滤器过滤后，转移到液相进样小瓶，-80 ℃下保存，待进行液相色谱-质谱分析。所有提取试剂使用前均在-20 ℃进行预冷。

1.3.2 液相色谱分析条件

色谱柱：Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：45 ℃；流动相A为体积分数0.1%甲酸-水溶液、流动相B为体积分数0.1%甲酸-乙腈溶液；梯度洗脱条件为0～2 min：95% A；2～4 min：80% A；4～9 min：75% A；9～17 min：40% A；17～19 min：0% A；19～20 min：95% A；流速：0.4 mL/min；进样体积：5 μL。

1.3.3 质谱分析条件

采用电喷雾离子源，样品质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式，条件如表1所示。

表1 分析花生红衣组分的质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters for component analysis of peanut skins

1.4 数据统计与分析

将花生红衣样品分为3 组并分别进行3 次生物学重复实验，第1组为‘冀花4号’，第2组为‘四粒红’，第3组为‘国育2016’。3 组样品之间的对比分别记为2/1、3/1、3/2，其中2/1表示‘四粒红’与‘冀花4号’之间的代谢物比较，3/1和3/2以此类推。

所有样品在正负离子模式下的总离子流图经代谢组学处理软件Progenesis QI进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和归一化，得到一个保留时间、质荷比（m/z）和峰强度的数据矩阵。将数据矩阵导入SIMCA软件包，并进行无监督的主成分分析（principal component analysis，PCA）和有监督的（正交）偏最小二乘法（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）分析，依据OPLS-DA模型第一主成分的变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值＞1.0、t检验的P＜0.05来筛选组间的差异代谢物[21]。代谢物主要依据其色谱峰保留时间及质荷比（m/z），用Progenesis QI代谢处理软件基于公共数据库（http://www.hmdb.ca/和http://www.lipidmaps.org/）及上海鹿明生物科技有限公司自建数据库进行定性。利用KEGG（http://www.genome.jp/KEGG/pathway.html）代谢途径对差异代谢物的代谢通路进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同品种花生红衣的PCA

通过对所有花生红衣样品的基峰色谱图进行可视化检查，发现所有样品的仪器分析均信号强、峰容量大且保留时间重现性好。‘冀花4号’、‘四粒红’和‘国育2016’这3 种花生红衣的正负离子模式下的总离子流图如图2所示。

图2 花生红衣的负离子模式（A、B、C）和正离子模式（D、E、F）总离子流图Fig. 2 Total ion current chromatograms in negative ion model (A, B and C) and in positive ion model (D, E and F) of peanut skins

利用SIMCA软件将图1的数据结果进行无监督的PCA，得到花生红衣的PCA得分图（图3）。从图3可以看出，3 组花生红衣的数据点在得分图上可以明显区分，‘冀花4号’位于第三象限内，‘四粒红’位于第四象限内，‘国育2016’位于第二象限内，表明3 组花生红衣样品中的代谢物存在明显差异（代谢物数量、浓度、种类等）[22-23]。由图3可知，每组花生红衣样品的3 次生物学重复数据能够很好地集中在一起，说明在实验过程中数据的重现性较好，代谢组组间的分析数据可信度较高[23]。

图3 花生红衣的PCA得分图Fig. 3 PCA score plots for peanut skins with different colors

2.2 差异代谢物的热图分析

表2 花生红衣的显著差异代谢物Table 2 Significantly differential metabolites of peanut red skins with different colors

采用多维分析和单维分析相结合的方法，根据OPLS-DA生成的VIP值来筛选组间差异代谢物（VIP＞1）。VIP值越大，说明该差异代谢物对样品组间的分类判别的影响强度和解释能力越强[24]。对‘冀花4号’、‘四粒红’和‘国育2016’分别进行组间分析比较，发现3 组样品中均存在的差异代谢物共有218 个。在此基础上，对组间具有较显著差异的代谢物进行进一步筛选，最终得到16 种差异代谢物（VIP＞5），如表2所示，主要包括黄酮类、黄酮醇类、有机酸类、酯类、肽类、酚类等。已有报道指出花生红衣含有黄酮类物质（毛地黄黄酮、芦丁、异鼠李黄素配糖体等）[8]、酚酸类物质（阿魏酸、绿原酸、对香豆酸等）[25]以及多酚物质（原花色素、白藜芦醇等）[26]等。Lou Hongxiang等[27]分离花生红衣中的多酚物质，鉴定其结构为表儿茶素-(2β→O→7,4β→6)-儿茶素和表儿茶素-(4α→8)-没食子儿茶素-(4α→8)-儿茶素等。而采用代谢组学分析花生红衣，鉴定出其中含有的小分子物质种类更加丰富、全面，从而为后续花生红衣代谢物分析结果的准确性提供有利的数据支撑。

采用聚类热图对16 种差异代谢物在不同花生红衣品种中的分布情况进行分析。从图4可以看出，颜色较深的花生红衣（‘四粒红’和‘国育2016’）含有的山柰酚和表儿茶素-(4α→8)-没食子儿茶素-(4α→8)-儿茶素明显较多，且随着红衣颜色的加深，原花青素、杨梅素和槲皮素含量明显增高。相比于颜色较浅的花生红衣，颜色较深的花生红衣中含量较高的差异代谢物主要包括酚类、黄酮类和黄酮醇类化合物，其具有一定的药理保健作用（如抗氧化、抗炎、防衰老等）[25]，有利于调节人体免疫机能[24]；因此颜色较深的花生红衣是治疗慢性疾病的理想选择，具有广阔的开发前景。对这16 种差异代谢物的相关性进行聚类分析，根据相关系数可以将其分为3 组（图4），第1组包括原花青素、杨梅素和槲皮素，第2组包括芦丁，其余12 种差异代谢物归为第3组。

图4 花生红衣品种间显著差异代谢物的热图分析Fig. 4 Heat map analysis of differential metabolites in peanut skins from different cultivars

2.3 差异代谢物的代谢通路分析

图5 花生红衣差异代谢物参与代谢通路富集图Fig. 5 Enrichment of differential metabolites in metabolic pathways

图6 花生红衣的黄酮和黄酮醇生物合成代谢通路（‘四粒红’与‘冀花4号’对比分析）Fig. 6 Flavone and flavonol biosynthesis pathways in peanut skins (comparison between ‘Silihong’ and ‘Jihua 4’)

通过MBRole通路分析功能，利用差异代谢物的KEGG ID进行通路富集分析。由图5可知，这16 种差异代谢物参与的代谢途径有10 条，P＜0.05表示差异显著，P值越小，则该代谢通路的差异性越显著，图5中P＜0.05的代谢途径有4 条，分别是黄酮和黄酮醇生物合成、类黄酮生物合成、磷脂代谢和线粒体中的脂肪酸伸长，其中黄酮和黄酮醇生物合成途径最为显著（P最小）。参与黄酮和黄酮醇生物合成代谢通路的有4 个差异代谢物，分别是山柰酚、槲皮素、杨梅素和芦丁。山柰酚是一种多酚类抗氧化物，属于黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌和保肝等功效[28]。槲皮素也是一种黄酮类化合物，具有抗氧化、抗病毒、抗炎等多重生理活性，可用来治疗肝、心、脾、肺、肾、骨科等疾病[29]。杨梅素属于黄酮醇类化合物，具有抗炎镇痛、抗肿瘤、降血糖、保肝和抗氧化等多种药理活性，尤其在防治心血管疾病方面作用明显[30-31]。芦丁属于黄酮类化合物，具有抗紫外线、抗炎、抗病毒及恢复毛细血管正常弹性等多种生理活性，临床上可用于防治脑溢血、视网膜出血等[32-33]。将‘四粒红’与‘冀花4号’对比分析，‘四粒红’的山柰酚在黄酮和黄酮醇生物合成通路中代谢旺盛，而槲皮素、杨梅素和芦丁合成量较少（图6）；对‘国育2016’与‘冀花4号’对比分析，‘国育2016’的山柰酚和芦丁在黄酮和黄酮醇生物合成通路中代谢旺盛；将‘国育2016’与‘四粒红’进行对比分析，‘国育2016’的槲皮素和杨梅素在黄酮和黄酮醇生物合成通路中代谢旺盛。由此可知，颜色较深的花生红衣（‘四粒红’和‘国育2016’）中的山柰酚代谢旺盛，颜色较浅的花生红衣（‘冀花4号’）中杨梅素和槲皮素代谢旺盛，合成量较多。

3 结 论

本实验利用代谢组学分析3 种不同颜色花生红衣中（颜色由浅到深依次是‘冀花4号’、‘四粒红’和‘国育2016’）的差异代谢产物并富集代谢通路，以期为花生红衣的综合利用及种源选择提供科学参考。结果表明不同颜色的花生红衣存在较大的代谢差异，依据>OPLS-DA模型的VIP值共筛选出16 种差异代谢物，颜色较深的花生红衣（‘四粒红’和‘国育2016’）山柰酚和表儿茶素-(4α→8)-没食子儿茶素-(4α→8)-儿茶素含量明显较多，且随着红衣颜色的加深，原花青素、杨梅素和槲皮素含量明显升高。富集差异代谢物的差异显著代谢通路共4 条，其中最显著的为黄酮和黄酮醇生物合成途径，山柰酚、槲皮素、杨梅素和芦丁4 种差异代谢物参与此通路，山柰酚在颜色较深的花生红衣中代谢旺盛，而杨梅素和槲皮素则在颜色较浅的花生红衣中代谢旺盛，合成量较多。