花青素与小麦蛋白相互作用及对蛋白质结构的影响

王 晨，谢岩黎*，范亭亭

（河南工业大学粮油食品学院，河南省粮油食品安全检测与控制重点实验室，河南 郑州 450001）

面筋蛋白是小麦粉中的主要储存蛋白，主要由醇溶蛋白（gliadin，Gli）及麦谷蛋白（glutenin，Glu）组成[1]。Gli属于单体蛋白，有4 种类型，分为α、β、γ、ω四种类型，Gli决定面团的黏性[2]。Glu是多肽链通过分子间二硫键相互连接成的大分子聚合物，主要由2 种亚基组成，分别为低分子质量亚基和高分子质量亚基，其分子内含有较多的β-折叠结构，易发生聚集作用，主要为面团提供弹性[3-4]。

花青素是植物多酚类化合物的其中一种，它广泛存在于谷物、水果和蔬菜中，并且可以产生鲜艳的色彩[5]。由于它能够预防心血管疾病、癌症并具有抗炎、抗菌及抗氧化的能力，近年来膳食花青素受到越来越多的关注[5-7]。以富含花青素的谷物如黑豆粉为配料，添加到小麦粉中加工成主食品。在食加工中，多酚类会与小麦粉中的蛋白质发生共价或共价交联，从而影响到面团的流变性及面制品的品质[8-10]。Hager等[11]发现没食子酸交联蛋白质可以改善面筋蛋白的弹性；Liu Rui等[9]向小麦粉中添加低聚原花青素可以改善面团的黏弹性及面筋蛋白的稳定性。这些植物多酚可以通过二硫键、氢键和疏水相互作用和面筋蛋白发生相互作用[6]。天然植物多酚对人体也有很多益处，包括抗氧化、抗菌和抗动脉硬化作用[9]，它还能降低过敏性。例如，Pérot等[7]发现蔓越莓多酚能够有效降低小Gli的免疫原性和致敏性。因此，植物多酚作为天然、安全、有效的小麦粉添加剂，能够有效地提高面制品的营养价值及增筋作用。但是多酚对于面筋蛋白的作用机制并不清楚，了解多酚与面筋蛋白（Gli和Glu）的相互作用方式及本质是必要的。本实验利用多光谱学研究了花青素与面筋蛋白（Gli和Glu）的相互作用。

本实验利用荧光光谱和傅里叶变换红外光谱研究花青素与Gli、Glu相互作用之间的表观结合常数、结合位点数、作用力及对两种蛋白结构的变化，为花青素对主食品品质的影响及花青素作为一种天然食品添加剂在主食品产业发展提供可靠的理论基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

矢车菊素-3-O-葡糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G），纯度98%，由实验室自制[12]；Gli（纯度95%）上海梯希爱化成工业发展有限公司；Glu（纯度＞85%）上海源叶生物科技有限公司；实验中所用试剂均为分析纯；所用水为去离子水。

1.2 仪器与设备

UV-6100S型分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；F-7100FL荧光分光光度计 日本Shimadzu公司；ALPHA傅里叶变换红外光谱仪 德国布鲁克分析仪器（上海）公司；LGJ-10C冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司；DL-5-B离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

C3G溶液：用pH 7.0的磷酸缓冲液配制50 mg/L的C3G溶液，实验时稀释到所需质量浓度；Gli溶液：称取一定质量的Gli，用75%乙醇溶液溶解，溶液稀释至100 mg/L。Glu溶液：称取一定质量的Glu，用pH 7.0的磷酸盐缓冲液（10 mmol/L）溶解，离心（因为Glu只溶于稀酸或稀碱），取上清液稀释至需质量浓度，备用。

1.3.2 荧光光谱分析

向一定浓度的Gli及Glu溶液添加不同量的C3G溶液，使最终蛋白质质量浓度为50 mg/L，C3质量浓度分别为0、4.49、8.99、13.48、17.97、22.47、26.96 mg/L，于25、35、45 ℃的恒温水浴锅中水浴1 h后测定。荧光光谱测定条件：激发波长280 nm，发射波长300～450 nm，激发波长和发射波长狭缝宽度均为5 nm，同步荧光光谱测定条件如下：25 ℃，分别设定激发波长与发射波长之间的固定波长差Δλ为15 nm及60 nm，进行同步荧光光谱扫描。

1.3.3 傅里叶变换红外光谱分析

将Gli-C3G、Glu-C3G的混合液（Gli质量浓度为50 mg/L、Glu质量浓度50 mg/L、C3G质量浓度分别为0、13.48、26.96 mg/L）冷冻干燥，按样品粉末与溴化钾粉末质量比1∶50混合，置于模具中压片，分辨率为32 cm-1扫描16 次，在4 000～4 00 cm-1波数范围内扫描红外光谱。

利用Peak Fit4.12软件对图谱中1 700～1 600 cm-1酰胺I带区域进行分析，通过校正基线、去卷积、二阶导数求导，将不同的谱带完全分辨开，参照文献[13]确定各子峰与不同二级结构的对应关系后（表1），根据各子峰面积计算各部分二级结构的相对含量。

表1 蛋白质红外光谱吸收波数与二级结构的关系[13]Table 1 Relationship between infrared absorption characteristics and protein secondary structure

1.4 数据统计分析

每组数据均做3 次平行，利用Origin 8.5软件进行数据处理与作图。利用SPSS 16.0软件进行ANOVA差异显著性分析及相关性分析，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 荧光光谱分析

2.1.1 C3G对Gli、Glu内源性荧光光谱的影响

荧光光谱法是研究小分子与蛋白质相互作用较为普遍的方法。由于荧光基团与猝灭剂分子的相互作用使得量子产率减小，从而产生荧光猝灭现象[14]。一般发荧光的蛋白质分子含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，它们最大荧光强度的波长分别为348、303 nm和282 nm[15]。由于酪氨酸极易被猝灭，苯丙氨酸量子产率过小，研究小分子物质与蛋白质相互作用常用色氨酸的荧光信息。以280 nm为激发波长，蛋白质的全部荧光主要来源于色氨酸，其次还有酪氨酸。而以295 nm为激发波长，蛋白质的荧光全部来源于色氨酸，但是其荧光强度过低[16]。本实验以280 nm为激发波长研究C3G与Gli、Glu的相互作用。

图1 C3G对Gli（A）、Glu（B）荧光光谱的影响Fig. 1 Fluorescence emission spectra of C3G-Gli (A) and C3G-Glu (B)systems at pH 7.0 and 25 ℃

由图1可知，C3G对两种蛋白的荧光都有猝灭作用，且猝灭效果随C3G质量浓度的增大而增强。在激发波长280 nm，Gli、Glu的最大发射波长（λmax）分别为342.2 nm（图1A）和342.6 nm（图1B），加入C3G后，Gli、Glu的λmax都发生了红移现象，这说明C3G与两种蛋白都发生了相互作用，导致Gli、Glu的色氨酸周围微环境由疏水性环境向亲水性环境发生转变，C3G是水溶性物质，可与蛋白质的亲水性侧链残基发生相互作用从而使得蛋白质的肽链变得更加伸展，从而使得蛋白质的构象发生变化[17-18]。而Gli红移1.6 nm，Glu红移1 nm，这说明C3G与Gli作用更强。

2.1.2 荧光猝灭机理的判定

小分子结合蛋白的荧光猝灭机制荧光猝灭分为静态猝灭与动态猝灭，静态猝灭由于猝灭剂与荧光基团形成复合物，其猝灭常数随着温度的上升呈下降的趋势。动态猝灭表现为温度的升高增加离子的扩散和碰撞，其猝灭常数随着温度的上升而增大。利用Stern-Volmer方程对猝灭类型进行判断[2]：

式中：F0、F分别为不添加C3G与添加C3G后黑豆分离蛋白的荧光强度；[Q]为C3G浓度/（mol/L）；KSV为动态猝灭常数/（L/mol）；Kq为生物大分子猝灭速率常数/（L/（mol·s））；τ0为不存在猝灭剂时荧光分子的寿命，平均寿命约为10-8s。

图2 不同温度条件下C3G猝灭Gli（A）、Glu（B）的Stern-Volmer图Fig. 2 Stern-Volmer plot of F0/F as a function of C3G concentration at different temperatures for C3G-Gli (A) and C3G-Glu (B) systems

表2 C3G-Gli、C3G-Glu复合物的荧光猝灭常数及线性相关系数Table 2 Stern-Volmer quenching constants (KSV) and molecular quenching constants (Kq) for C3G-Gli and C3G-Glu systems at different temperatures

根据Stern-Volmer方程（1），以F0/F为纵坐标，对[Q]进行线性拟合，经Origin 8.5绘制得图2，进而得出C3G 与Gli、Glu相互作用的动态猝灭常数（KSV）和生物大分子猝灭速率常数（Kq）。由表2可知，随着温度的升高，Glu的KSV不断减小，这说明C3G对Glu的荧光猝灭机制属于静态猝灭。对于生物大分子，各类猝灭剂由扩散碰撞产生的最大动态猝灭常数为2×1010L/（mol·s）[16-17]，又因为C3G与Glu相互作用的Kq值远大于2×1010L/（mol·s），进一步表明C3G对Glu的猝灭机理是C3G与蛋白结合形成基态稳定复合物所引起的静态猝灭。温度由298 K升到308 K时，C3G与Gli相互作用的猝灭常数呈现增大的趋势，由308 K升到318 K时，KSV值变化不大，而C3G对Gli的猝灭速率常数Kq远大于最大猝灭常数，可以得出C3G与Gli的相互作用方式是动态猝灭和静态猝灭同时发生。Joye等[19]研究发现温度由35 ℃上升至40 ℃时，白藜芦醇和Gli相互作用的KSV值也呈现增大的趋势，之后保持不变，这与本实验中C3G与Gli相互作用的结果一致。

2.1.3 结合常数和结合位点的计算

根据文献，测定荧光分子和猝灭剂相互作用的结合常数和结合位点数，采用以下公式计算：

式中：F0和F分别为不添加C3G与添加C3G后黑豆分离蛋白的荧光强度；[Q]为C3G浓度/（mol/L）；KA为结合常数；n为结合位点。

图3 不同温度条件下 C3G-Gli（A）和C3G-Glu（B）复合物的双对数图Fig. 3 Plot of lg[(F0-F)/F] as a function of log of C3G concentration at different temperatures for C3G-Gli (A) and C3G-Glu (B) systems

根据公式（2），以lg[（F0-F）/F]对lg[Q]作图（图3），计算出不同温度条件下C3G与Gli、Glu相互作用的表观结合常数（KA）和结合位点数（n）（表3），以上数据表明：温度升高，C3G与Gli的结合常数KA值升高，说明升高温度增大了C3G-Gli复合物的稳定性，且两者的反应是吸热过程[20]。而Glu有着相反的趋势，说明C3G与Glu的反应是一个放热过程。不同温度条件下，C3G与Gli相互作用的KA和n分别为20.827×104L/mol、1.263（298 K），22.463×104L/mol、1.253（308 K），58.060×104L/mol、1.355（318 K）。相比于Glu，C3G与Gli相互作用的KA和n都较大，说明C3G与Gli的结合能力较强。这两种蛋白的结合位点数n都接近 1，由此可知C3G与两种蛋白之间都形成了物质的量比约1∶1的静态复合物[21]。

表3 C3G-Gli和C3G-Glu复合物的结合位点数、表观结合常数及线性相关系数Table 3 Apparent binding constants, number of binding sites and linear correlation coef fi cients of C3G-Gli and C3G-Glu systems

2.1.4 热力学参数与相互作用力类型

根据Van’t Hoff方程用计算热力学参数[22-23]：

式中：ΔH、ΔG和ΔS分别表示焓变/（kJ/mol）、吉布斯自由能变化/（kJ/mol）、熵变/（J/K）；R为气体常数8.314 J/（mol·K）；T为实验温度；KA为相应的温度下的结合常数；结合反应的焓变在温度相差不大时，可视为常数[23]。

小分子和蛋白结合的相互作用力主要有4 种：1）ΔH＞0、ΔS＞0时，疏水相互作用；2）ΔH＞0、ΔS＜0时，静电和疏水相互作用；3）ΔH＜0、ΔS＜0 时，范德华力和氢键相互作用；4）ΔH＜0、ΔS＞0时，静电相互作用[22]。从表4可以看出，对Gli而言，ΔH＞0、ΔS＞0，说明C3G与Gli之间的作用力主要为疏水作用，ΔH＞0，表明两者之间的相互作用为吸热反应，升温应有利于两者结合；而对Glu而言，ΔH＜0、ΔS＜0，说明C3G与Glu的主要作用力为范德华力和氢键，ΔH＜0，表明C3G和Glu之间的反应是放热的，降温应有利于两者结合。另外，两种蛋白的ΔG都小于0，说明C3G与这两种蛋白的结合都是自发的。

表4 C3G与Gli、Glu结合的相关热力学参数Table 4 Thermodynamic parameters of C3G-Gli and C3G-Glu systems

2.1.5 同步荧光光谱

图4 C3G-Gli和C3G-Glu体系的同步荧光光谱Fig. 4 Synchronous fluorescence spectra of C3G- Gli and C3G-Glu systems

同步荧光分析被应用于研究蛋白质的构象，特别是荧光基团微环境的变化，具有选择性高、谱图简化、光散射干扰少等特点[24]。通过设定Δλ，获得荧光光谱。当Δλ为15 nm时，只显示酪氨酸残基的特征荧光光谱；当Δλ为60 nm时，只显示色氨酸残基的特征荧光光谱[25]。所以，可判断蛋白质酪氨酸残基和色氨酸残基在C3G作用下附近微环境的极性变化。

从图4可以看出，随着C3G质量浓度的增大，Gli、Glu的酪氨酸和色氨酸残基荧光强度均有猝灭现象且最大吸收波长均有不同程度的红移现象。这说明C3G与两种蛋白都发生了相互作用，并使得蛋白质构象发生一定的改变，进而使得两种蛋白中色氨酸和酪氨酸附近的微环境向亲水性环境转变，疏水性减小[26-27]。Gli中酪氨酸残基（图4A1）和色氨酸残基（图4A2）分别红移0.2 nm和0.4 nm；而Glu酪氨酸残基（图4B1）和色氨酸残基（图4B2）分别红移1.2 nm和0.8 nm，这说明C3G与Gli的结合位点更接近色氨酸残基，而与Glu的结合位点更接近酪氨酸残基[28]。

2.2 傅里叶变换红外光谱

图5 C3G与Gli、Glu复合的Peakfit拟合图谱Fig. 5 Secondary derivative resolution enhancement and curve fi tted amide I band

蛋白质酰胺I带吸收峰的变化反映了蛋白二级结构的变化（1 700～1 600 cm-1）[13]，由图5可知，加入不同浓度的C3G后，两种蛋白的红外拟合峰数目及峰形发生明显变化，蛋白的二级结构所占百分比也发生改变，表明加入C3G后，两种蛋白的构象都发生了改变。由表5可知，两种蛋白质的二级结构中，β-折叠结构所占比例最高。随着C3G的加入，Gli中β-折叠和β-转角结构有减少的趋势，而α-螺旋和无规卷曲含量有增大趋势，这与Tozzi等[29]的研究结果一致，可能是由于C3G和Gli作用后形成了复合物，导致肽链上羰基氢键的重排，从而引起Gli结构的变化。Glu中β-折叠含量减少，α-螺旋和β-转角含量增加，而无规卷曲含量无明显变化（P＞0.05），这与史春悦[30]的研究结果一致，可能是由于C3G与Glu之间形成的键是由疏水相互作用引起的。相比于C3G对Glu二级结构的影响，可以检测到C3G存在时Gli更多的变化，可能是由于C3G与Gli的相互作用更强[31]。这与内源性荧光的结果一致。

表5 C3G对Gli、Glu蛋白质二级结构相对含量的影响（x± s，n=3）Table 5 Effect of C3G concentration on secondary structure of Gli and Glu (x± s, n= 3)%

3 结 论

本实验采用荧光光谱、同步荧光光谱和傅里叶变换红外光谱3 种方法研究C3G与Gli、Glu的相互作用及对蛋白质结构的影响，主要结论如下：1）荧光图谱结果表明C3G对Gli、Glu都有荧光猝灭作用，与Glu的猝灭机制属于静态猝灭，主要通过疏水相互作用相结合；与Gli的猝灭机制为静态猝灭和动态猝灭的结合，主要通过范德华力和氢键作用结合。2）Gli、Glu与C3G结合位点数n都接近1，形成了物质的量比约1∶1的静态复合物；同步荧光光谱表明C3G与Gli的结合位点更接近色氨酸残基，而与Glu的结合位点更接近酪氨酸残基。3）傅里叶变换红外光谱数据表明C3G的加入改变了小麦蛋白结构，Gli表现为β-折叠和β-转角占总空间结构百分比减少，而α-螺旋和无规卷曲结构相对含量增加；Glu表现为β-折叠相对含量减少，α-螺旋和β-转角相对含量增加，无规卷曲相对含量变化不大。