鸭疫里默氏杆菌分离株生物被膜的检测

来景辉, 胡青海

(1.宿州职业技术学院，安徽 宿州 234101；2.中国农业科学院 上海兽医研究所，上海 200241)

鸭疫里默氏杆菌病又称鸭传染性浆膜炎，是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella Anatipestifer，RA)引起家鸭、鹅、火鸡及其他鸟类感染的一种高度接触性、高致死性传染病，感染动物常呈急性或慢性败血症。自然条件下家鸭最易感染，年龄越小，发病率和死亡率越高[1-2]。临床上常表现为精神沉郁、不食、离群呆立等，并伴有肝周炎、纤维素性心包炎和气囊炎等病理变化；部分出现脑膜炎、干酪性输卵管炎、结膜炎、关节炎等病理变化；死亡率可高达75%，病鸭由于生长缓慢，通常会变成残次鸭或者僵鸭。临床上鸭疫里默氏杆菌可以形成生物被膜。细菌生物被膜(Bacteria Biofilm，BBF)是其在生长的过程中为了适应外界的环境而形成的细菌菌体聚集的生存方式，一般情况下是膜状结构，这一层的细菌膜结构可以黏附于物质的表面，也可以包裹在自身胞外多糖基质当中[3]。对于自然界中的细菌而言生物被膜对于抗生素的耐受以及免疫逃避等方面发挥着至关重要的作用，进而导致了细菌对宿主的持续感染或者慢性感染[4-5]。RA产生生物被膜与该病在养鸭场持续性感染有关还有待于继续研究。本研究用结晶紫法检测21株RA形成生物被膜的比例以及形成能力，并研究两种常用抗生素在RA生物被膜形成过程中的作用，从而为临床上提供防治该病的提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

结晶紫(购于生工生物工程有限公司)；TSB培养基(NaCl 5.0 g，胰蛋白胨17.0 g，K2HPO42.5 g，大豆胨3.0 g，Glucose 2.5 g)，无水乙醇均购于国药试剂公司。E.coli DH5a购于Invitrogen公司。RA CH3株来自上海兽医研究所。头孢哌酮、四环素均购于生工生物工程有限公司。TSA培养基制备:在1 000 mL TSB液体培养基中加入琼粉15 g，高压灭菌，无菌倒皿后，4 ℃冰箱保存备用。试验用水经121 ℃下灭菌15 min。

1.2 测定项目及分析方法

1.2.1 生物膜形成的检测 结晶紫法测定生物膜形成。将实验室分离的21株RA和E.coli DH5a转接种到TSB培养基中，经37 ℃摇床150 rpm震荡培养16 h。

用TSB液将培养菌液稀释到最佳浓度OD655约为0.1 ug/mL，并将稀释的溶液加入96孔平板中，每孔200 μL，放置在37 ℃的CO2培养箱中24 h。静置培养后弃去上清液，用200 μL 0.01 mol/L PBS轻轻洗涤每孔3次，自然干燥后向每个孔加入200 μL 0.1%结晶紫，在室温下作用30 min后弃除结晶紫，用超纯水洗涤4次并自然晾干；向每孔加入100 μL 95%无水乙醇使剩余结晶紫充分溶解，并测量其在595 nm时的吸光度，E.coli DH5a作为阴性对照。标准：当测定的RA菌株生物被膜的OD595≥0.31时，作为菌株能形成生物被膜的浓度，约为阴性对照值的2倍左右；根据生物膜形成的强度，将这些菌株人为分为3类:生物被膜形成能力强株(OD595≥1)，生物被膜形成能力弱株(0.31

1.2.2 生物膜对抗生素作用的影响测定 取CH3 24 h培养液，用TSB液稀释至最佳浓度OD655为0.1 μg/mL，并将稀释的溶液加入96孔平板中，每孔200 μL，分别加入不同浓度(0.024～1 000 μg/mL)的四环素、头孢哌酮，放于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养24 h后，将生物被膜吹散后分光光度计测OD655值。

判定标准：可抑制细菌出现的最低药物浓度作为最小抑菌浓度；每孔10 μL菌液中经培养没有可见细菌生长的浓度，而且在TSA培养基平板上经24 h培养没有细菌生长的药物浓度作为最小杀菌浓度。

2 结果与分析

2.1 不同菌株生物被膜检测

采用结晶紫染色法检测21株鸭疫里默氏杆菌菌株生物膜形成，发现在96孔平底聚乙烯板中培养检测的21株鸭疫里默氏杆菌中，有11株鸭疫里默氏杆菌能形成生物被膜，约占比为52.38%(11/21)；在这11株能形成生物被膜的鸭疫里默氏杆菌中，有6株OD595≥1，属于强形成株；有5株0.31

图1 用结晶紫染色法检测鸭疫里默氏杆菌生物被膜的形成

2.2 生物被膜对抗生素作用的影响

通过检测MIC和MBC来比较头孢哌酮、四环素对有无生物被膜形成状态下的CH3的影响。结果发现，不论是MIC还是MBC，生物膜状态的药物浓度都远远高于浮游状态下的浓度，约为4～27倍；说明生物被膜具有保护菌体免受抗生素损害的能力。另一方面，两种状态下头孢哌酮的有效浓度远低于四环素的用药浓度，说明试验鸭疫里默氏杆菌菌株对头孢哌酮高度敏感。临床上注射头孢哌酮的治疗效果要好于四环素。

表1 头孢哌酮、四环素对CH3 的悬浮状态和生物被膜形成状态的MIC和MBC

3 结论与讨论

目前,国内大部分养鸭集中地区的鸭场都被此病所困扰，一个鸭场的鸭群一旦被鸭疫里默氏杆菌感染后就很难从这个鸭场根除此病，从而影响养殖效益，所以一些养鸭专业户常采取的措施是过几年就转移到另外一个场地建立新的鸭场，大大增加了养鸭的成本。使用安全、有效的菌苗是预防本病的一项重要措施。但是，越来越多的血清型在我国出现，增加了防治鸭疫里氏杆菌感染的难度，所以当务之急必须对当地RA血清型作好监测工作，同时还需进一步完善免疫学的快速诊断方法，加强鸭疫里氏杆菌病病理学、免疫学、血液学及其发病机理和免疫机能等方面研究，以明确临床病理特征，为临床诊治和免疫预防提供科学依据。

推测生物被膜可能是环境中鸭疫里默氏杆菌重要的储存库，使鸭疫里默氏杆菌病在同一个鸭场可反复发生和流行，难以清除的原因。试验检测的21株鸭疫里默氏杆菌中，52.38%(11/21)的菌株能形成生物被膜，与胡青海等研究的41.86%的RA能形成生物被膜的结果相似。有研究表明因为生物被膜的存在，在临床上可有效保护菌体免受抗菌药物的损害，增加临床治疗本病的难度。本试验的研究发现形成生物被膜的CH3 比其没有形成生物膜状态对头孢哌酮、四环素更加耐受，与相关报道相符。这种耐受现象表明RA菌株可能在一些鸭场形成生物被膜从而导致该病在鸭场持续性感染，在适当的条件下，这些存活的细菌就能引起新一轮感染。

粘附、发展和成熟是生物被膜的形成过程的3个阶段[6-7]，生物膜形成过程涉及一系列基因信号转导通路的开启或关闭[8-9]。探讨分析鸭疫里默氏杆菌生物被膜形成的分子机制，生物被膜的形成与病菌持续性存在相关性作为研究重点。因此研究参与生物被膜形成的相关基因，为抗细菌性感染特别是难治性感染提供了崭新的途径。在此基础上，研究分析生物被膜形成相关基因在形成强、弱和不形成生物被膜的鸭疫里默氏杆菌菌株中的分布，以筛选鸭疫里默氏杆菌生物被膜形成过程中的关键基因，为研究鸭疫里默氏杆菌生物被膜形成的分子机制，以及筛选抑制鸭疫里默氏杆菌生物被膜形成的靶标等奠定基础。有研究表明[10]：鸭疫里默氏杆菌菌株均携带asrpdp、dhdps、ftsq和hthdp基因是与鸭疫里默氏杆菌生物被膜形成相关的保守基因，将可能是潜在的药物靶标，既可以抑制或破坏鸭疫里默氏杆菌生物被膜的形成，又可能抑制或杀灭所有的鸭疫里默氏杆菌，为鸭疫里默氏杆菌的防控提供新的思路。