电子顺磁共振技术在药学实验中的应用探索

赵淑锐，郑美青，吴英婷，王耀楠

电子顺磁共振技术在药学实验中的应用探索

赵淑锐，郑美青，吴英婷，王耀楠

（首都医科大学 中心实验室，北京 100069）

电子顺磁共振（ESR）技术是检测单电子的唯一的直接分析方法，该文将这种方法应用到了药学专业实验教学中。通过NO自由基的清除实验教学，不仅使学生直接接触了现代大型电子顺磁共振仪，熟悉了NO自由基的产生、捕捉机理及清除方法，还培养了学生的科研思维，形成了药学专业人才培养特色，提高了学生的综合实验技能。

药物化学实验；电子顺磁共振仪；一氧化氮自由基

在药学相关的实验教当中，知识体系构建对学生科研思维形成具有非常重要的作用，有助于学生从连续性的实验中认识药物化学的发展过程，培养科研型思维[1]。针对“药学专业实验II”[2-3]，本文利用药学仪器平台的大型仪器，建立了新的自由基清除模型，开发了新的自由基清除方法，完善了药学专业实验教学内容。该项实验教学，旨在使学生掌握这项新技术，并将其运用到自由基清除剂新药研究工作中[4-7]。

自由基是含有未成对电子的原子基团，化学性质非常活泼，容易失去或得到电子发生氧化还原反应，在体内的多种疾病发生、发展过程中扮演重要角色。由于自由基非常活泼，在检测过程中如果操作不及时，就会导致自由基淬灭而失去检测机会。因此快速准确检测自由基，对于监测疾病发生、发展过程尤为重要。

电子顺磁共振（ESR）是直接检测和研究含有未成对电子的顺磁性物质的一种现代分析方法[8]，也是检测单电子唯一的直接方法，具有灵敏度高、无干扰、样品不受破坏等优点，是目前检测自由基最直接、最有效的方法之一[9]。电子顺磁共振仪是针对自由基单电子设计的大型仪器，用其研究生物体内自由基的释放与清除是目前科学研究的前沿热点。

1 自由基清除实验设计背景及实验的可行性

NO自由基具有重要的生物功能，是内皮细胞松弛因子，能抑制血小板凝聚，由于是自由基，因此具有自由基的两面性。除了生物功能外，它还具有反应性强和细胞毒性的一面，对心血管既有保护作用又可能有损伤作用[10]，体内NO产生过多可导致内皮细胞损伤和死亡。近年来,人们相继发现某些血管性疾病和神经功能性障碍，如高血压、心血管疾病、糖尿病、肺及肾病、男性性功能障碍等[11]，都伴有NO异常。

“药学专业实验II”是围绕化合物2-(3’-硝基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3-二氧基咪唑啉、2-(3’-硝基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1-氧基咪唑啉的合成、鉴定及生物活性评价展开的[2-3]。有文献报道，目标化合物能有效清除NO自由基[12]，保护血管内皮细胞免受自由基攻击。

2 NO自由基的清除实验设计

任务：药物的生物活性评价——NO自由基的清除。

仪器：JEOL FA-300电子顺磁共振仪、移液枪、EP管、分析天平、玻璃毛细管（0.9~1.1 mm）、封口胶、顺磁管。

试剂：七水合硫酸亚铁（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、S-亚硝基-N-乙酰青霉胺（SNAP，≥97%，sigmsa）、N-(Dithiocarbamoyl)-N-methyl-D-glucamine sodium salt(MGD,dojindo)、超纯水自制。

被测样品：2-(3’-硝基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3-二氧基咪唑啉和2-(3’-硝基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1-氧基咪唑啉的分子结构见图1和图2。

图1 2-(3’-硝基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3-二氧基咪唑啉分子结构

图2 2-(3’-硝基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1-氧基咪唑啉

样品测试条件：扫描时间1 min、中心磁场330 mT、扫描宽度15 mT、微波功率1 mW、调制宽度0.35 mT。

实验目的：测定化合物的ESR图谱以及化合物对NO自由基的清除作用。

3 实验过程

3.1 概述

将所需测试的样品溶液（10–4mol/L）虹吸入石英毛细管中，外加石英样品保护管。放入ESR波谱仪的谐振腔中测定样品图谱（见图3、图4）。

NO自由基捕捉清除实验采用S-亚硝基-N-乙酰青霉胺（SNAP）作为NO自由基的供体，不断释放NO，用亚铁盐和N-甲基-D-葡萄糖胺（MGD）的络合物捕捉NO自由基而形成(MGD)2-Fe2+-NO复合物。(MGD)2-Fe2+-NO复合物ESR图谱如图5所示。NO自由基的捕捉体系如下：

2MGD + Fe2+(MGD)2-Fe2+

图3 2-(3’-硝基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3-氧基咪唑啉ESR图谱

图4 2-(3’-硝基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1-二氧基咪唑啉ESR图谱

图5 (MGD)2-Fe2+-NO复合物ESR图谱

3.2 步骤

将10 mmol/L的七水合硫酸亚铁水溶液、25 mmol/L的MGD水溶液、蒸馏水及1 mmol/L的SNAP水溶液，按顺序各取5 μL注入EP管，混匀后快速装入石英毛细管中，然后外加样品保护测试管，一并放入电子顺磁共振仪的谐振腔中。在测试液反应2 min时上机测试，记录NO信号第一个峰高度。重复3次作为空白对照样品，以扣除试剂本身对自由基的影响。然后进行样品测试，此时用样品溶液代替蒸馏水。蒸馏水及被测样品的ESR图谱见图6，其中，A为蒸馏水样品，B为被测样品。

图6 蒸馏水样品和被测样品ESR图谱

自由基清除率的计算公式为=[(0–h)/0]× 100%。其中，0为对照样品中ESR图谱信号强度测量值，h为样品中ESR图谱信号强度测量值。值越大，清除自由基能力越强。

体系中加入待测样品相比加入蒸馏水的NO加合物自由基信号明显降低，ESR图谱对比如图7、图8所示。其中，A为体系中加入蒸馏水后的ESR图谱，B为体系中加入2-(3’-硝基苯)-4,4,5,5-四甲基-1,3-二氧基咪唑啉后的ESR图谱，C为体系中加入2-(3’-硝基)-4,4,5,5-四甲基-1-氧基咪唑啉后的ESR图谱。说明化合物对NO自由基有明显的清除作用。测定不同浓度的化合物溶液，可计算出化合物清除NO自由基的半数抑制浓度。

图7 体系中加入待测样品与加入蒸馏水的ESR图谱对比之一

图8 体系中加入待测样品与加入蒸馏水的ESR图谱对比之二

4 注意事项及结果讨论

由于自由基的不稳定性，每次实验所需的试剂都要现用现配，对于自由基的产生及捕捉要严格控制反应时间及测试时间，以保证实验的可比性。学生可针对不同浓度的化合物溶液，计算其清除NO自由基的半数抑制浓度。实验步骤中未明确给出具体化合物浓度，意在要求学生自主进行样品浓度设定。一般应先从大浓度开始，然后再针对倍比稀释后的不同浓度的样品，直至得到活性基本接近空白对照的最小浓度的样品。最后根据不同样品浓度的实验结果计算半数抑制浓度，指导后续实验。通过该实验，学生不仅要会做，还要会想，要主动思考问题。实验操作步骤介绍要有详有略，既能对学生起到实验操作指导作用，又要给学生留下充足的思考空间[13]。

5 结语

本文探讨了电子顺磁共振技术以及电子共振仪的生物分析方法在药学专业实验中的应用。通过实验，学生了解电子顺磁共振仪的构造及原理、工作过程及NO自由基的捕捉方法和测定方法。在实验中，将电子顺磁共振技术在科研上的新知识、新理论、新技术和新方法介绍给学生，使他们了解科技前沿动态，增加学习兴趣，提高学习热情。通过使用大型仪器，提高了实验教学层次，形成了药学实验教学特色，学生不仅能够掌握这项新技术，还可将其运用到自由基清除剂新药研究工作中。

[1] 邵建群，张枫，何深知，等.药学专业综合应用型实验模式与运行实践[J]. 西北医学教育，2013, 21(3): 527–530.

[2] 赵明.专业药学实验(Ⅰ)[M]. 北京: 首都医科大学，2009.

[3] 赵明.专业药学实验(Ⅱ)[M]. 北京: 首都医科大学，2009.

[4] 赵光，闫淑莲，林婷，等.培养科研型思维药学人才的探索[J].实验技术与管理，2014, 31(6): 30–32.

[5] 何深知，崔纯莹，段薇，等.在设计性实验中培养学生的综合能力[J].实验技术与管理，2009, 26(6): 134–136.

[6] 金成树，迟云超，赵大伟，等.应化专业综合化学实验中培养应用型人才的研究[J].广东化工，2011, 38(3): 185, 188.

[7] 樊媛洁，闫淑莲，杨华. 在药学实验教学改革过程中培养学生的能力[J].首都医科大学学报（社科版），2007(8): 128–129.

[8] 胡喜兰，韩照祥，陶莹，等. DPPH法测定17种植物的抗氧化活性[J].食品科技，2006(10): 264–268.

[9] 陈士明. 电子顺磁共振波谱仪[J].上海计量测试，2003(1): 45–47.

[10] 赵保路. 电子自旋共振技术在生物和医学中的应用[M].合肥：中国科学技术大学出版社，2009.

[11] 周泉生，阮长耿. 一氧化氮及其合成酶异常与疾病[J].生理科学进展，1995.

[12] JUNLING L, MING Zhao, CHAO Wang, et al. Synthesis and bioactivities of nitronyl nitroxide and RGD containing pseudopeptides[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2003, 13(22): 4065–4069.

[13] 闫淑莲，唐静成，何深知，等.药学专业综合性实验的设计与研究[J].中国医学装备，2015, 12(6): 21–24.

Application of electron paramagnetic resonance in pharmaceutical experiments

ZHAO Shurui, ZHENG Meiqing, WU Yingting, WANG Yaonan

(Central Laboratory, Capital Medical University, Beijing 100069, China)

Electron paramagnetic resonance (ESR) is the only direct analytical method for single electron detection, and this method has been applied to the experimental teaching of Pharmacy specialty. Through the experimental teaching of NO free radical scavenging, students are not only directly exposed to modern large-scale electronic paramagnetic resonance instruments and familiar with the generation, capture mechanism and scavenging method of NO free radical, but also train their scientific research thinking, form the characteristics of cultivating pharmaceutical talents and improve their comprehensive experimental skills.

medicinal chemistry experiment; electron paramagnetic resonance instruments; nitric oxide radicals

R91；G642.423

A

1002-4956(2019)10-0201-03

10.16791/j.cnki.sjg.2019.10.048

2019-01-24

赵淑锐（1983—），女，北京，硕士，主管技师，从事大型仪器管理维护与实验教学工作。E-mail: zhaoshurui@163.com