低氮对茶树生长及叶片抗氧化酶活性的影响

林郑和，钟秋生，游小妹，陈志辉，陈常颂，单睿阳，阮其春

(福建省农业科学院茶叶研究所，福建 福安 355015)

近几年来，我国的茶业产业发展较快速。据相关数据统计，截至2017年底，我国茶园面积超过4588万亩，占世界茶园面积总量的一半，年茶叶产量达到269多万吨[1]，已成为世界上茶叶面积最大，产量最高的国家，茶园氮肥的施用年均66万吨(每亩茶园按施氮量15 kg计算)。产量随作物氮肥用量呈线性增加[2]。氮素亏缺直接影响着作物的生命活动和产量形成[3]，氮素亏缺条件下植物的次生代谢发生的变化，如叶绿体色素和蛋白质的丢失、脂质过氧化和膜的改变，导致叶片光合能力的逐步下降。然而，Logan等人[4]发现缺氮的菠菜叶片抗氧化酶显著增加。为了保护光合作用器官免受氧化胁迫，植物必须消耗掉多余的光能，可以通过叶黄素循环或者过氧化物酶反应降低光化学效率[5]。活性氧(ROS)对所有植物体都具有高度破坏性和毒性，必须尽量减少其产生[6,7]，细胞内ROS的积累通常较低，但在不利的环境因素下，ROS的产生可能增强[8]，可引起膜质的脱脂化和过氧化，破坏生物膜的结构和功能。然而植物体内存在抗氧化机制，可以在一定程度上减缓这种伤害。为了应对细胞内ROS的产生，植物具有复杂的酶抗氧化系统，其中包括细胞解毒的关键酶，如：单脱氢抗坏血酸还原酶(MDAR)、超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)等；非酶促抗氧化体系重要的有抗坏血酸(ASC)、还原型谷胱甘肽(GSH)等[9,10]，有效地清除细胞内过多的ROS，维持细胞内ROS的产生和清除在一个平衡状态，使细胞免受伤害。目前低氮对植物活性氧变化影响主要集中在苦荞[11]、咖啡[12]、小麦[3,13]、玉米[14]，而关于茶树氮亏缺对抗氧化酶的影响相关并未见到。本研究以前期筛选出的耐低氮茶树品种‘黄棪’与氮敏感茶树品种‘本山’为试验材料[15]，测定低氮下ROS及各抗氧化酶活性的变化，以期为茶树耐低氮种质的筛选与鉴定提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验方法

试验于2017年3～10月在福建省福安市社口镇福建省农业科学院茶叶研究所完成。试验采用盆栽沙培。沙子用干净的河沙，盆用陶土花盆，大小：高为20 cm，底部直径为20 cm，顶部直径为30 cm，每盆装入6 kg的沙子，沙子使用前用去离子水洗净、晾干备用。试验用10月龄的黄棪与本山的扦插苗为材料，每盆栽2株，6个不同浓度(0、50、100、300、1200、6000 μmol·L-1N)的氮处理，每处理20盆，于自然温、光条件下培养。营养液参照林郑和[16]的配方配制，完全营养液包含3 mmol·L-1NH4NO3，0.5 mmol·L-1Ca(H2PO4)2，1.0 mmol·L-1K2SO4，0.5 mmol·L-1CaCl2，0.6 mmol·L-1MgSO4，46 μmol·L-1H3BO3，9 μmol·L-1MnSO4，9 μmol·L-1ZnSO4，2 μmol·L-1CuSO4，2.6 μmol·L-1Na2MoO4和30 μmol·L-1Fe-EDTA。具体实施：移栽，待幼苗成活后每次每盆各处理分别施含0、50、100、300、1200、6000 μmol·L-1N的NH4NO3营养液约500 mL，每周3次，处理18周后(缺氮处理出现明显的症状：叶色变黄、植株矮小、分枝减少、叶片衰老加快等)，进行取样、检测。为了防止盆栽苗涝害，盆底有个漏洞，放有瓦片，避免积水及沙子遗漏。

1.2 测定方法

1.2.1 植株分枝数、株高及根茎叶干重的测定 分枝数与株高的观测参照《茶树种质资源描述规范和数据标准》。根、茎、叶干重测定参考林郑和等[16]。茶树小心从花盆中拔起(保持完整的根系)，用自来水冲洗干净，然后用剪刀把根、茎、叶分开，每个处理设置4个重复(不同盆中的1株为1个重复)，将鲜样凉干后，放入烘箱中，80℃下烘48 h(至恒重)，然而用电子天平测定各部分的重量。

1.2.2 茶树根茎叶氮含量的测定 氮含量的测定：采用浓H2SO4-H2O2消煮，用凯氏定氮仪(FOSS)进行测定，参照林郑和等[15,16]。

1.2.3 茶树叶片丙二醛(MDA)与过氧化氢(H2O2)的测定 丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法(TBA)测定，具体参照Hodges等[18]的方法进行。双氧水(H2O2)的测定参照Chen等[19]。

1.2.4 抗氧化酶活性测定 叶片抗氧化酶活性的提取与测定参考林郑和等[9]与Chen等[19]，具体步骤如下：从超低温冰箱中取3个圆叶片(每个叶面积0.608 cm2)，放入研钵中，加2 mL提取液缓冲液[0.5%(w/v)曲拉通X-100，1 mM EDTA，50 mM KH2PO4-KOH(pH 7.5)，5%(w/v)不溶性PVPP]，在冰浴中研磨成匀浆，匀浆用冰冻离心机15 000 g下离心10 min，上清液用于酶活性测定。CAT、APX、MDAR、DHAR和 GR活性测定按Chen等[19]与林郑和[9]。SOD活性采用氮蓝四唑(NBT)光还原法测定，GSH和ASC含量测定按照Chen等[19]的方法进行。过氧化物酶(POD)活性的测定采用愈创木酚法，参考Chen等[19]进行。

1.3 数据分析

采用DPS(V15.10)软件进行差异显著性(LSD法)分析，利用Sigmaplot 10.0软件进行作图。所有数据均重复4～6次(不同植株为1个重复)。

2 结果与分析

2.1 不同供氮处理对茶树分枝数、株高及根茎叶干重的影响

从图1(A)可看出，随着供氮浓度的增加两品种的分枝数依次显著增加，除供氮1200 μmol·L-1N处理外，其余处理中黄棪品种的分枝数显著高于本山品种，特别在低氮处理(供氮处理为0、50、100 μmol·L-1)下。从图1(D)中发现两品种植株高度在供氮为0、50、100 μmol·L-1显著下降，其余处理间未见显著变化。图1(B、C、E)发现，随着供氮浓度的增加，除本山品种在供氮为6000 μmol·L-1外，两品种根、茎、叶干重依次增加。根系干重除50、100 μmol·L-1氮处理外，其余处理黄棪干重都高于本山，叶片干重在供氮处理为0、50 μmol·L-1时，黄棪品种显著高于本山，其余处理未见明显差异。茎干重除供氮处理6000 μmol·L-1，其余处理两品种未见显著差异。根冠比(图1F)在供氮处理下未见显著差异，而本山品种的根冠比显著高于黄棪。随着供氮浓度的增加，两品种植株干重(图1G)都依次增加，然而黄棪品种的干重除供氮300 μmol·L-1处理外，其余处理均高于本山。

图1 供氮处理对茶树分枝数、株高及根茎叶干重的影响Fig.1 Branch count, plant height, and dry weight (DW) of roots, stems, and leaves of tea plants in relation to N supply注：每个柱为4次重复的平均值±标准差，同一点字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.2 不同供氮处理对茶树根系、茎、叶氮含量的影响

从图2中看出，茶树随着供氮浓度从0增加到6000 μmol·L-1，茶树根、茎、叶氮含量依次增加，其中氮含量叶片>根系>茎。从图2A与C中发现相同供氮处理下，黄棪叶片、根系的氮含量都高于本山品种，茎的氮含量(图2B)除0、100 μmol·L-1处理外，其余处理黄棪都高于本山。

图2 供氮处理对茶树根茎叶氮含量的影响Fig.2 N content in roots, stems, and leaves of tea plants in relation to N supply注：每个柱为6次重复的平均值±标准差，同一点字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.3 不同供氮处理对茶树叶片过氧化氢与MDA含量的影响

从图3发现，供氮处理为0、50 μmol·L-1时，叶片过氧化氢的产生速率(图3A)与MDA(图3B)含量显著增加，并且发现，本山品种中的过氧化氢与丙二醛都显著高于黄棪品种。供氮处理从300增加到6000 μmol·L-1，各处理间未见明显变化。

2.4 不同供氮处理对茶树叶片抗氧化系统各酶活性的影响

从图4A中发现随着供氮浓度的增加，叶片SOD(图4A)活性依次下降，而GR(图4B)、CAT(图4C)、DHAR(图4D)、MDAR(图4E)、APX(图4F)、POD(图4G)活性却依次增加。供氮处理为0、50 μmol·L-1时，黄棪品种叶片的GR(图4B)、CAT(图4C)显著高于本山品种，其余各处理除CAT供氮100 μmol·L-1处理外，其余各处理两品种间未见显著变化。DHAR(图4D)活性除供氮为50 μmol·L-1处理外，其余处理黄棪叶片中的DHAR活性都高于本山；MDAR(图4E)活性黄棪与本山相当或者本山略高于黄棪；APX(图4F)活性在供氮从0增加到100 μmol·L-1时，黄棪品种显著高于本山，其余各处理两品种未见显著变化；POD活性(图4G)除300、1200 μmol·L-1处理本山显著高于黄棪外，其余处理两品种未见显著变化。

图3 供氮处理对H2O2(A)与MDA(B)含量的影响Fig.3 H2O2 (A) and MDA content (B) in leaves of tea plants in relation to N supply注：每个柱为4次重复的平均值±标准差，同一点字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.5 不同供氮处理对茶树叶片ASC与GSH含量的影响

从图5发现，随着供氮浓度的增加，ASC含量依次增加，而除本山1200 μmol·L-1处理外，GSH含量也随着供氮的增大而增加。还发现ASC含量在两品种间未见明显差异，而GSH含量黄棪品种明显高于本山。

3 讨论与结论

作物氮肥通常直接影响作物的生物量、代谢、结构，了解作物对氮素的反应机制是维持和提高作物生长和产量的关键，也是提高氮素利用率的关键[20, 21]。缺氮下茶树分枝数与树高显著的下降(图1A与D)，氮素限制的主要目标是分生组织[22]，这一结果与本研究相类似。

图4 供氮对茶树叶片SOD(A)、GR(B)、CAT(C)、DHAR(D)、MDAR(E)、APX(F)与POD(G)活性的影响Fig.4 Activities of SOD (A), GR (B), CAT (C), DHAR (D), MDAR (E), APX (F), and POD (G) in leaves of tea plants in relation to N supply注：每个柱为4次重复的平均值±标准差，同一点字母不同表示差异显著(P<0.05)。

图5 供氮对茶树叶片ASC(A)与GSH(B)含量的影响Fig.5 ASC (A) and GSH (B) in leaves of tea plants in relation to N supply注：每个柱为4次重复的平均值±标准差，同一点字母不同表示差异显著(P<0.05)。

本研究表明，随着供氮浓度的增加，茶树根、茎、叶干重显著增加，说明高氮能引起茶树对氮的奢侈吸收，增加植株氮积累，加速茶树营养生长，这与水稻[22]、玉米[23]等报到相一致。研究发现，低氮下茶树根、茎、叶干重都显著下降(图1B、C、E)，这与阮建云等[24]、苏有健等[25]在茶树低氮下的报道相一致。主要因为氮含量降低严重影响茶树根、茎、叶中蛋白质、氨基酸、光合产物等的合成所致。

本研究还发现，黄棪品种施氮下根、茎、叶干重明显高于本山品种，除根系干重除50、100 μmol·L-1，茎干重6000 μmol·L-1处理外，其余处理黄棪品种均高于本山。从干物质分配角度看，品种和氮肥同时起作用，不同基因型茶树品种对氮肥吸收、利用是不同的，这表明施氮对不同茶树品种调节程度不同，这与徐祥玉等[26]报道相一致。本研究发现本山品种根冠比都大于黄棪品种，这可能因为供氮下本山品种增强对N及光合作用产物吸收，而使得这些产物累积在根部所致[27-29]，也侧面说明了氮高效品种黄棪在低氮下氮素利用较本山品种高。

氮含量是指单位土地面积上植物各器官所含氮元素的质量。缺氮明显减少茶树根、茎、叶氮含量，根、叶氮含量的减少较茎更为显著，叶片氮含量高于根、茎，说明氮素从根系向叶片转运，最后主要累积在叶片，供蛋白质、氨基酸等代谢物质合成用。在最大供氮时，叶片氮含量增加最大，而在不供氮或者低氮处理时，根茎叶之间氮含量差异很小，说明低氮处理使氮素向地上部(茎和叶)的转移比例增加。这与李强等[30]在水稻上的研究结果相类似。低氮下本山品种根、茎、叶氮含量都要低于黄棪品种，说明低氮下黄棪品种能更有效的吸收、转运氮。这与魏艳丽等[31]在施氮对不同小麦品种氮素效率利用的报到相一致，氮高效品种氮素利用率更大。其中还发现黄棪品种根系氮含量随着供氮的增加，氮含量变化尤为显著，说明黄棪对氮肥的利用率要高于本山。

MDA是膜脂过氧化的产物，是衡量细胞膜损伤程度的重要指标。张英鹏等[35]研究表明，在低氮导致了菠菜体内MDA和超氧自由基积累，从而使膜脂产生过氧化作用，影响菠菜的正常生长，这与本研究缺氮下叶片MDA含量显著增加相类似。本研究还发现缺氮下黄棪品种的GR、CAT、APX与GSH活性都高于本山品种，这与耐氮玉米品种[14]、耐低氮苦荞品种(‘迪庆苦荞’、‘广苦1号’)[11]低氮胁迫下的报道相一致。

综上所述，缺氮胁迫下导致茶树幼苗的生长发育受到抑制(根、茎、叶干重显著下降)，本山品种根冠比都大于黄棪品种，说明其缺氮对本山品种生长影响较大，耐低氮品种在低氮环境中具有明显的生长优势，耐低氮能力较强。缺氮下茶树MDA与H2O2有所增加，且本山品种增加的尤为显著，且相关的抗氧化酶(POD、CAT、GR、GSH等)黄棪品种都高于本山，说明耐低氮品种黄棪缺氮环境下能更好调节保护自身，免受伤害，更好的适应缺氮环境。